Tiến hành 4 mẫu thí nghiệm chiết rút fucoidan từ rong nâu S.oligocystum theo 3 qui trình đã đưa ra ở phần vật liệu và phương pháp nghiên cứu. Mỗi mẫu thí nghiệm sử dụng 1kg rong khô hoặc 7,7 kg rong tươi (tùy theo quy trình) để thu nhận fucoidan. Các mẫu thí nghiệm đều lặp lại 3 lần, kết quả trung bình chung giữa các lần thí nghiệm. Sau khi thu nhận fucoidan tiến hành sấy khô đến trọng lượng không đổi và cân định lượng hàm lượng fucoidan thô. Sau đó, tiến hành định lượng fucoidan tinh khiết trong sản phẩm fucoidan thô bằng phương pháp 3 (PP3) [25] và tính hiệu suất thu nhận fucoidan tinh khiết. Kết quả thu được thể hiện ở bảng 3.9, hình 3.9 và hình 3.10.
Bảng 3.9. Kết quả đánh giá fucoidan thu nhận từ rong nâu S.oligocystum tách chiết theo 3 phương pháp khác nhau
Phương pháp chiết
Chỉ tiêu Đơn vị
tính KT1 KT2 KT3 KT4
Khối lượng sản phẩm fucoidan thô
g
31,6 30,3 32,4 33,6
Tỷ lệ fucoidan tinh khiết % 80,25 78,47 90,3 76,32
Hiệu suất thu nhận fucoidan (tính theo hàm lượng fucoidan tinh khiết)
%
78,51 73,61 90,58 79,39
Hình 3.9. Sự thay đổi tỷ lệ fucoidan tinh khiết trong các mẫu sản phẩm fucoidan
Hình 3.10. Hiệu suất thu nhận fucoidan tinh khiết từ rong nâu S.oligocystum khi
tách chiết theo 3 qui trình khác nhau. Nhận xét:
Từ kết quả xác định hàm lượng fucoidan chiết tách từ rong nâu S.oligocystum
bằng các qui trình khác nhau thể hiện trong bảng 3.9, hình 3.9 và hình 3.10, cho thấy hàm lượng fucoidan thu được từ rong nâu S.oligocystum tách chiết bằng phương pháp khác nhau dao động từ 3,03% đến 3,36% so với khối lượng rong khô. Hiệu suất chiết của phương pháp 3 là 90,58% cho thấy phương pháp 3 nấu rong trong nước và CaCl2 cho hiệu suất chiết fucoidan lớn nhất. Hiệu suất tính theo fucoidan tinh thu được thấp nhất khi tách chiết theo phương pháp 2 và hiệu suất tính theo fucoidan tinh thu được chỉ đạt 73,61%.
Từ kết quả đánh giá khả năng thu nhận fucoidan từ 3 loại rong nâu phổ biến tại Khánh Hòa theo 3 qui trình chiết rút. Phương pháp 1, 2, 4 chiết rút ở pH=2 thì rong không được mềm như bình thường, thành tế bào trở nên cứng hơn và từ đó việc chiết tách fucoidan khó khăn hơn, đồng nghĩa với việc fucoidan từ trong tế bào rong bị tách ra không triệt để và khi chiết ở pH=2 thì một phần alginate tan nên vẫn còn lẫn trong fucoidan trong công đoạn tủa cồn nên fucoidan thu được không sạch hoàn toàn alginate. Chính vì vậy, nên phương pháp chiết 1, 2, 4 cho hiệu suất thu nhận fucoidan tinh khiết không cao và tỷ lệ fucoidan tinh khiết trong sản phẩm thô cũng thấp.
Hàm lượng fucoidan thu được khi tách chiết theo phương pháp 1, 2 cũng thấp do chiết ở nhiệt độ phòng, hàm lượng alginate thoát ra ít. Với điều kiện nhiệt độ đó, việc tinh sạch fucoidan có thể dễ dàng hơn, tuy nhiên alginate không thoát ra được sẽ giữ một phần fucoidan trong màng tế bào, và sẽ bị loại bỏ theo bã rong nên hàm lượng fucoidan thu được không cao.
Phương pháp 2 tiến hành ngâm rong tươi trong cồn ở 500C, 22 giờ, sau đó lấy bã rong để chiết fucoidan, nên quá trình ngâm rong trong cồn cũng làm thất thoát một lượng fucoidan trước khi tiến hành chiết tách fucoidan. Chính vì vậy, hàm lượng fucoidan thu được theo phương pháp 2 khá thấp so với các phương pháp khác.
Qua việc sử dụng các phương pháp tách chiết khác nhau để thu nhận fucoidan,
cho thấy phương pháp tách chiết fucoidan theo phương pháp 3 (nấu rong trong nước
và CaCl2) cho tỷ lệ fucoidan tinh khiết trong sản phẩm fucoidan thô cao nhất, đồng
nghĩa với phương pháp chiết cho hàm lượng fucoidan sạch nhất và hiệu suất tính theo
fucoidan tinh cao nhất. Tuy nhiên, đây chỉ là khảo sát trên hiệu suất tách lấy fucoidan, ngoài vấn đề này, phương pháp có giá trị hay không còn phụ thuộc vào việc fucoidan thu được có hoạt tính sinh học gì hay không. Với mức độ nghiên cứu fucoidan mới bắt đầu của Việt Nam, việc khảo sát thử khả năng thu nhận fucoidan của 3 qui trình nêu trên có tính mở đầu cho những nghiên cứu tiếp theo về sau, hoặc những học sinh, sinh viên muốn sử dụng fucoidan cho kháng đau dạ dày hoặc hỗ trợ điều trị u bằng phương pháp chiết theo bản quyền EP0645143A1 có số liệu để tính toán qui hoạch thực nghiệm và tính toán giá thành. Chính vì thế, phương pháp này được sử dụng để tối ưu hóa các thông số, xây dựng quy trình chiết mới, cải tiến một số công nghệ để phù hợp với đặc điểm của các loài rong nâu và đồng thời giảm thời gian, nhiệt độ tách chiết nhưng lại thu được hiệu suất thu hồi fucoidan cao, đặc biệt là giữ được hoạt tính sinh học của fucoidan thu được sau khi tách chiết.
Từ kết quả đánh giá khả năng thu nhận fucoidan từ 3 loại rong nâu phổ biến tại
Khánh Hòa theo 3 qui trình chiết rút, ta thấy loài rong nâu S.polycystum cho hàm
lượng fucoidan cao nhất trên cả 3 qui trình nên lựa chọn loài rong này để tách chiết
3.2.4. Xây dựng qui trình cải tiến tách chiết fucoidan từ rong nâu
* Tối ưu hoá công đoạn xay rong nâu trên một loài rong cho hiệu suất
fucoidan cao nhất (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Tiến hành tối ưu hóa các thông số trên công đoạn xay theo qui trình chiết tách fucoidan với nước và CaCl2 theo bản quyền EP0645143A1. Vì loài rong S.polycystum
cho hàm lượng fucoidan cao nhất nên sử dụng S.polycystum tối ưu hóa tại công đoạn xay rong nâu theo quy trình xay chiết mới. Nghiên cứu sự biến đổi sản lượng fucoidan trong công đoạn xay được thực hiện theo các thí nghiệm đã quy hoạch (mục 2.2.3.3) với 8 thí nghiệm trong phương án và 3 thí nghiệm ở tâm. Tất cả các thí nghiệm đều được lặp lại 3 lần. Giá trị trung bình của 3 lần lặp lại thí nghiệm thu được fucoidan thô. Sản phẩm fucoidan thô được xác định hàm lượng fucoidan tinh theo PP3 [25]. Kết quả xác định hàm lượng fucoidan tinh khiết thu được khi định lượng theo PP3 được thể hiện trong bảng 3.10 và hình 3.11.
Bảng 3.10. Hàm lượng fucoidan (g/100g rong khô) thu được ở các chế độ xay
khác nhau Số TN Z1 Z2 Z3 X1 X2 X3 X12 X13 X23 X123 Y 1 1 50 8 10 - - - + + + - 2 2 90 8 10 + - - - - + + 2,4 3 50 14 10 - + - - + - + 1,6 4 90 14 10 + + - + - - - 1,8 5 50 8 50 - - + + - - + 2,8 6 90 8 50 + - + - + - - 3,6 7 50 14 50 - + + - + + - 1,8 Số thí nghiệm trong phương án 2k 8 90 14 50 + + + + + + + 2,6 9 70 11 30 0 0 0 0 0 0 0 2,44 10 70 11 30 0 0 0 0 0 0 0 2,36 Số thí nghiệm ở tâm 11 70 11 30 0 0 0 0 0 0 0 2,4
Trong đó: U1: Nhiệt độ (0C) U2: pH
U3: Thời gian xay (phút)
Hình 3.11. Hàm lượng fucoidan thu được theo các chế độ xay khác nhau
Nhận xét:
Từ kết quả xác định hàm lượng fucoidan chiết tách fucoidan từ loài rong
S.polycystum bằng phương pháp xay chiết mới với các điều kiện chiết khác nhau thể hiện trong bảng 3.10 và hình 3.11, cho thấy hàm lượng fucoidan thu được cao nhất là 3,6g/100g rong khô ở điều kiện chiết là nhiệt độ 900C, pH=8 và thời gian là 50 phút. Ở điều kiện này, nhiệt độ 900C và thời gian 50 phút rong được làm mềm và được xay nát, hàm lượng alginate và fucoidan được tách ra khỏi rong triệt để nên hàm lượng fucoidan thu được cao nhất. Hàm lượng fucoidan thu được thấp nhất là 1,6g/100g rong khô ở điều kiện chiết 500C, pH=14 và thời gian là 10 phút. Ở điều kiện, nhiệt độ 500C có thể rong chưa mềm, hàm lượng alginate còn lại trong rong sẽ giữ fucoidan lại và bị loại bỏ theo bã rong và thời gian 10 phút quá ngắn, không đủ thời gian cho rong được xay nát nên các chất không thoát ra triệt để, do vậy ở điều kiện này thu được hàm lượng fucoidan thấp nhất. Vì vậy, ở điều kiện chiết là nhiệt độ 900C, pH=8 và thời gian là 50 phút cho hàm lượng fucoidan tinh khiết thu được là cao nhất.
Theo phương pháp trực giao ba yếu tố, phương trình hồi quy được biểu diễn theo dạng sau: Y1 = b0 + b1X1 + b2X2 + b3X3 + b12X1X2 + b13X1X3 + b23X2X3
Giải bài toán quy hoạch thực nghiệm bằng phần mềm Modde 5.0, ta nhận được các kết quả như trong bảng 3.11 và hình 3.12.
Bảng 3.11. Ảnh hưởng của các biến độc lập đến sản lượng fucoidan trong công đoạn xay
Yếu tố Hệ số phương
trình hồi quy Độ lệch chuẩn Giá trị P
Hằng số 2,34545 0,0215705 4,28985e-008 X1 0,275 0,0252937 0,000406224 X2 -0,375 0,0252937 0,000120508 X3 0,375 0,0252937 0,000120508 X1*X2 -0,025 0,0252937 0,378915 X1*X3 0,125 0,0252937 0,00780598 X2*X3 -0,125 0,0252937 0,00780596 - Yếu tố nhiệt độ: Y Investigation: Tuy7 (MLR) Response Surface Plot
Y Investigation: Tuy7 (MLR) Contour Plot - Yếu tố pH : Y Investigation: Tuy7 (MLR) Response Surface Plot
Y
Investigation: Tuy7 (MLR) Contour Plot
- Yếu tố thời gian
Y
Investigation: Tuy7 (MLR) Response Surface Plot
Y
Investigation: Tuy7 (MLR) Contour Plot
Hình 3.12. Các biểu đồ thể hiện mức độ ảnh hưởng và mối tương quan
giữa các yếu tố đến hàm lượng fucoidan tinh khiết thu được.
Nhận xét:
Qua bảng số liệu 3.11, ta thấy các biến độc lập đều có ảnh hưởng đến sản lượng fucoidan (y), do giá trị P<0,05; ngoại trừ X1X2 do có P>0,05. Trong đó, nhiệt độ (X1), thời gian xay (X3) và X1X3 đều có tác dụng tích cực và ảnh hưởng dương đến sản lượng fucoidan thu được, còn pH (X2), X2X3 có ảnh hưởng âm đến sản lượng fucoidan thu được.
Từ kết quả thu được ở bảng 3.11 (căn cứ vào trị số P<0,05), ta thu được phương trình hồi quy của sản lượng fucoidan như sau:
Y1 = 2,35 + 0,28X1 - 0,38X2 + 0,38X3+ 0,13X1X3 – 0,13X2X3 (3.1) Trong đó: X1: Nhiệt độ (0C) (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
X2: pH
X3: Thời gian xay (phút)
Y1: Hàm lượng fucoidan tinh khiết thu được (g/100g rong khô)
Từ kết quả mức độ ảnh hưởng và mối tương quan giữa các yếu tố đến sản lượng fucoidan thể hiện trong hình 3.12, cho thấy:
- Đối với yếu tố nhiệt độ, khi pH càng giảm lên và thời gian càng cao thì hàm lượng fucoidan thu được càng cao. Khi pH=8 và thời gian 50 phút thì hàm lượng fucoidan thu được cao nhất.
- Đối với yếu tố pH, khi nhiệt độ càng cao và thời gian càng cao thì hàm hàm lượng fucoidan thu được càng cao. Khi nhiệt độ đạt 900C và thời gian 50 phút thì hàm lượng fucoidan thu được cao nhất.
- Đối với yếu tố thời gian, khi nhiệt độ càng cao và pH càng thấp thì hàm lượng fucoidan thu được càng cao. Khi nhiệt độ 900C và pH=8 thì hàm lượng fucoidan thu được là cao nhất.
Kết quả phân tích ANOVA cho yếu tố sản lượng fucoidan được thể hiện trong bảng 3.12.
Bảng 3.12. Kết quả phân tích phương sai ANOVA sảnlượng fucoidan
Sản lượng fucoidan DF SS MS F Total 11 63,6432 5,78575 Constant 1 60,5127 60,5127 Total Corrected 10 3,13047 0,313047 Regression 6 3,11 0,518333 101,273 Residual 4 0,0204727 0,00511817 N = 11 Q2 = 0,890 DF = 4 R2 = 0,993 Nhận xét:
Từ kết quả phân tích phương sai ANOVA sản lượng fucoidan thể hiện trong bảng 3.12, cho thấy kiểm định Fisher cho kết quả có ý nghĩa thống kê ở mức P<0,05 vì giá trị F từ kết quả quy hoạch thực nghiệm (101,273) lớn hơn nhiều so với giá trị f tra bảng (6,16). (tra bảng với = 0,05, bậc tự do 1 = 6, 2 = 4 ta được giá trị 6,1631 hoặc sử dụng Excel với hàm “=finv(0.05,6,4)” cũng cho kết quả tương tự)
Hai giá trị Q2 và R2 cho biết mức độ tin cậy của mô hình thí nghiệm, R2 là độ biến thiên thực, còn Q2 là độ biến thiên ảo. Trong đó, R2> 0,8 và Q2>0,5 (Gabrielsson và cs, 2002) và độ sai lệch giữa chúng nằm trong khoảng (0,2 - 0,3) (Eriksson và cs, 2000) cho thấy các giá trị hồi quy là có ý nghĩa và mô hình là đáng tin cậy.
Giá trị trong thí nghiệm này, R2 = 0,993 và Q2 = 0,890 thỏa mãn tất cả những điều kiện trên nên các giá trị hồi quy có ý nghĩa và mô hình đáng tin cậy.
Bảng 3.13. Kết quả điều kiện tối ưu của quá trình
Nhiệt độ pH Thời gian
90 8 50
Nhận xét:
Từ kết quả điều kiện tối ưu của quá trình được thể hiện trong bảng 3.13, cho thấy ở điều kiện chiết là nhiệt độ 900C, pH=8 và thời gian là 50 phút thu được hàm lượng fucoidan tinh cao nhất 3,6 g/100g rong khô gần tương thích với hàm lượng fucoidan thu được khi tách chiết theo PP3 [25] là 3,61g/100g rong khô.
3.3. ĐỀ XUẤT QUI TRÌNH THU NHẬN FUCOIDAN VÀ SẢN XUẤT THỬ
SẢN PHẨM
3.3.1. Đề xuất qui trình thu nhận fucoidan từ rong nâu
Hình 3.13. Qui trình sản xuất fucoidan
Alginate, bã rong Hợp chất PTL lớn
Loại acid alginic
Lọc vải thô
Lọc cát và than hoạt tính Lọc qua cột nhựa cationit Xay (rong/nước=1/15, 900C, 50 phút, pH=8) Kết tủa Ly tâm Sấy kết tủa Fucoidan tinh San hô, tạp chất Đất cát Rong nâu Phân loại Rửa 1 Rửa 2 Phơi khô Ngâm Nước máy Muối, màu 2 giờ EtOH (960) Dịch/cồn = 1/2
CaCl2 Trung hòa
Alginate, bã rong Hợp chất PTL lớn
Thuyết minh quy trình
Rong nâu: là loại rong tươi, lấy ở biển Hòn Chồng – Nha Trang, là hỗn hợp (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
nhiều loại rong nâu. Rong đạt tiêu chuẩn về độ trưởng thành, tùy loài mà có chuẩn về kích thước, màu sắc, độ to của phao.
Phân loại: nhằm loại bỏ phần rong bị dập, mềm, biến đen, độ nhớt tăng. Đảm bảo chất lượng rong đồng đều, cần loại bỏ rong tạp và tạp chất. Phân loại và chọn ra 3 loài rong nâu cần dùng để tiến hành thí nghiệm.
Rửa 1: Rửa bằng nước biển, thường khi lấy rong lên thì ta tiến hành rửa tại chỗ, nơi nước sạch và trong. Rửa phải đều tay, vuốt sạch rong, tránh dồn cục khi rửa để đảm bảo sạch rong. Loại bỏ đất cát, san hô và các tạp chất ngay ở công đoạn này. Sau khi rửa xong, rong được cho vào bao sạch và đưa lên bờ, chú ý giảm tiếp xúc với cát, tránh dính bám cát vào rong. Thời gian rửa nhanh, cần chuyển lên bờ để làm các công đoạn sau.
Rửa 2: Công đoạn này rửa bằng nước ngọt, dùng vòi nước cho chảy nhẹ và ngập rong, tiến hành rửa sạch, vuốt theo chiều cây rong, rửa qua 3 đến 4 lần nước ngọt để loại một phần muối dính bám vào rong và vi sinh vật trên cây rong. Trong công đoạn này nếu còn sót san hô hoặc các tạp chất thì cần loại bỏ ngay.
Ngâm: Sau khi rửa thì ngâm nước ngọt trong vòng 2 giờ, mục đích là để loại bỏ các chất màu, các muối và các hợp chất có trọng lượng phân tử thấp tan được vào trong nước có trong rong.
Phơi khô: rong sau khi rửa sạch và ngâm đủ 2 giờ thì tiến hành vớt rong ra và phơi rong. Rong được rải đều trên các giàn phơi. Cách 2 giờ thì trở mặt rong 1 lần nhằm tăng diện tích tiếp xúc với ánh nắng và lưu thông không khí tốt. Nếu trời nắng to thì chỉ cần phơi trong vòng 2 ngày. Vì khi đã tiếp xúc với nước ngọt thì rong rất nhanh bị nhão ra nên cần phơi rong vào những ngày nắng to để rong nhanh chóng khô tránh hư hỏng rong. Sau khi phơi khô thì rong nâu chuyển sang màu nâu đen, giòn, cứng. Sau đó thì cho vào bao, để ở nơi khô ráo thoáng mát và ở nhiệt độ thường để cân bằng độ ẩm.
Xay: đây là công đoạn quan trọng nhằm thu được fucoidan. Cho rong và nước máy vào nồi chiết theo tỷ lệ rong/nước là 1:15. Điều chỉnh pH của hỗn hợp nước và rong về pH=8 bằng dung dịch NaOH loãng. Nâng nhiệt nồi chứa rong đạt 900C. Tiến hành xay rong, chú ý giữ nhiệt 50 phút trong quá trình xay rong. Trong công
đoạn này các polysaccharide bị cắt thành mạch ngắn hơn, khối chất chiết trở nên loãng và linh động hơn. Điều này hoàn toàn thuận lợi cho công đoạn tách chiết tiếp theo.
Loại acid alginic: Trong rong nâu có rất nhiều hợp chất không phải là