2.2.3.1. Bố trí thí nghiệm xác định phương pháp định lượng fucoidan
Trong 3 loài rong, 2 loài rong điển hình S.mcclurei và S.polycystum được lựa chọn dùng để thí nghiệm xác định phương pháp định lượng fucoidan. 2 mẫu rong nâu
S.mcclurei và S.polycystum được tiến hành tách chiết fucoidan theo PP2 và PP3. Tiến hành thủy phân rong nâu và fucoidan của 2 loài rong nâu S.mcclurei và S.polycystum
theo PP1 và PP2. Sử dụng sản phẩm thủy phân rong nâu và sản phẩm thủy phân fucoidan thu được tiến hành chạy sắc ký khí để xác định hàm lượng đường fucose thu được. Từ đó làm cơ sở cho việc xác định hàm lượng fucoidan tinh trong các mẫu, tiến hành so sánh các phương pháp định lượng fucoidan và lựa chọn phương pháp thu được hàm lượng fucoidan tinh chính xác nhất. Thí nghiệm xác định phương pháp định lượng fucoidan bao gồm các phương pháp sau:
* Xác định fucoidan theo phương pháp 1 (PP1) [12]
30 mg rong nâu khô đã được sấy đến khối lượng không đổi ở 600C được cho vào ống nghiệm 10 ml có nắp vặn kín. 1 ml TFA (trifluoacetic axit) và 0,9 mg myo- inositol được thêm vào. Vặn chặt nắp, cho vào tủ sấy 1000C trong 8 giờ. Cho bay hơi đến khô trong tủ sấy hút chân không ở nhiệt độ 400C rồi thêm 0,5 ml MeOH cho bay hơi, lặp lại hai lần. Chất khô được dùng để phân tích thành phần đường theo phương pháp sử dụng GC (sắc ký khí).
* Phương pháp 2 (PP2) [8]
Rong nâu khô được cắt nhỏ cỡ mm, 100g rong được khuấy trộn đều với 1 lít dung dịch HCl 0,1N; chiết 24 giờ ở nhiệt độ phòng, thỉnh thoảng có khuấy trộn. Dịch chiết được tách ra khỏi bã rong và cô đặc bằng màng siêu lọc 1kDa đến còn khoảng 100ml. Dung dịch cetavlon 10% trong nước được đưa vào đến khi không còn tạo kết tủa. Kết tủa được lọc rửa bằng nước cất nhiều lần trên giấy lọc để tách bỏ laminaran và
mannitol …. Sau đó dung dịch 33,3g CaCl2 được đưa vào và đun nóng 600C khuấy liên tục trong 2 giờ và để yên qua đêm, muối cetavlon-fucoidan, cetavlon-alginic bị phá huỷ giải phóng ra fucoidan, đồng thời alginate calcium (nếu có) tách ra dưới dạng kết tủa. Ly tâm để thu dịch có chứa fucoidan. Hai thể tích EtOH so với thể tích dịch lọc được đưa vào và khuấy trộn trong 30 phút. Để yên qua đêm, kết tủa được tạo thành. Gạn lọc thu kết tủa và tiếp tục rửa bằng EtOH 80%(v/v) đến khi không còn inon Cl- trong nước rửa, hút chân không đến khan nước và sấy kết tủa ở 450C ở áp suất – 1bar, 18 giờ ta thu được hỗn hợp các fucoidan sạch. Các sản phẩm này được chạy phổ NMR để xác định sự có mặt của fucoidan và sử dụng để xác định hàm lượng fucose trong fucoidan tinh.
- Thủy phân fucoidan để xác định hàm lượng fucose
Mẫu fucoidan khô (0,2 mg) cho vào ống nghiệm có nút vặn thêm vào 0,02 mg inositol, thêm vào 0,3 ml TFA 2M, thuỷ phân 2 h ở 1200C. Cho bay hơi đến khô trong dòng khí ở nhiệt độ 400C rồi thêm 0,5 ml MeOH cho bay hơi, lặp lại hai lần.
- Thủy phân mẫu rong đã dùng tách fucoidan để xác định hàm lượng fucose được tiến hành theo phương pháp của Usov [12].
* Acetyl alditol hóa các mẫu chất khô thu được sau khi thủy phân:
+ Cho vào trong ống nghiệm, có chứa sản phẩm đã thuỷ phân; 0,3 ml NaBH4 0,25 M vừa pha xong trong NH4OH 1M để yên 30 phút ở 200C. Thêm vào hỗn hợp phản ứng 0,5 ml acid acetic 10% trong methanol cho bay hơi đến khô, lặp lại lần nữa. Cho vào ống nghiệm 0,5 ml MeOH bay hơi đến khô, lặp lại hai lần.
+ Acetyl hoá các gốc đường bằng 0,2 ml dung dịch Ac2O:pyridin=1:1(v/v) ở 1000C trong 20 phút. Cho bay hơi hỗn hợp phản ứng, thêm vào 0,5ml toluen, cho bay hơi đến khô, lặp lại hai lần.
+ Chiết sản phẩm đã acetyl hoá bằng acetate ethyl. Xác định thành phần đường với cột không phân cực trên GC-17A shimadzu FID. Chế độ nhiệt: 1600C, giữ 2 phút. Tăng đến 2800C, 100C/phút, giữ 20 phút để rửa cột. Các pic đường sẽ ra hết ở khoảng 7 phút, glucosamine nếu có sẽ ra ở hơn 8 phút.
* Tính toán hàm lượng fucoidan
- Theo PP1
Từ dịch thủy phân rong xác định được hàm lượng fucose là a%; Hàm lượng fucoidan sẽ là: a x 2 =2a%.
- Theo PP2
Từ dịch thủy phân rong xác định được hàm lượng fucose là a%. Từ dịch thủy phân fucoidan xác định được hàm lượng fucose là b%. Hàm lượng fucoidan sẽ là: 100 %
b x a
* Phương pháp 3 (PP3) [25].
(Xác định hàm lượng fucoidan bằng phương pháp tách chiết tinh chế fucoidan trên lượng rong lớn)
50g bột rong đã sấy khô đến khối lượng không đổi được đem trộn đều với 500 ml dung dịch axit HCl 0,1N; ngâm 24 giờ ở nhiệt độ phòng, thỉnh thoảng có khuấy trộn. Dịch được tách ra khỏi bã rong qua vải lọc, sau đó qua cột cát và than hoạt tính, tiếp theo được cô đặc bằng thiết bị lọc rây phân tử MWCO 1kDa đến khi còn 50 ml; 2,84g Na2SO4 được thêm vào khuấy tan, chia dung dịch thành 2 phần bằng nhau vào 2 ống ly tâm 50 ml đã biết trước khối lượng, rửa sạch cốc chia vào 2 ống, cân và điều chỉnh khối lượng 2 ống ly tâm đến bằng nhau bằng nước cất. Thêm vào mỗi ống 2 ml BKC 80% lắc đều trong 10 phút. Ly tâm, loại bỏ dịch trong. Thêm 30 ml nước cất vào mỗi ống, lắc rửa nhiều lần, ly tâm, để loại các chất khác (rửa nước khoảng 3 lần). Ly tâm lần cuối loại bỏ nước. Thêm 30 ml ethanol 90% và 2 g muối NaCl lắc mạnh hỗn hợp, kết tủa dính nhầy không tan trong nước, sẽ chuyển sang kết tủa fucoidan tinh, rời rạc, dễ tan trong nước, lắc rửa mạnh với 40 ml ethanol 85% (v/v) ba lần để rửa hết muối và BKC. Sau cùng mới rửa bằng ethanol tuyệt đối hoặc aceton. Sấy khô sản phẩm đến khối lượng không đổi, xác định khối lượng hai ống ly tâm, trừ cho khối lượng hai ống đã biết trước khi thực hiện thí nghiệm thu được kết quả khối lượng fucoidan tinh là M.
Hàm lượng fucoidan đó trong mẫu rong là: (M x 100)/50 (%) = 2M (%)
Trong đó M là khối lượng fucoidan tinh đã tách chiết được từ 50g rong
Tiến hành so sánh 3 phương pháp và lựa chọn phương pháp định lượng fucoidan chính xác nhất. Sau đó, ứng dụng phương pháp định lượng chính xác nhất vào xác định hàm lượng fucoidan trong 3 loài rong nâu S. mcclurei, S. polycystum, S.oligocystum. Tiến hành 3 mẫu thí nghiệm xác định hàm lượng fucoidan từ 3 loài rong nâu. Mỗi mẫu thí nghiệm sử dụng 100g rong khô. Các mẫu thí nghiệm đều lặp lại 3 lần, kết quả trung bình chung giữa các lần thí nghiệm.
2.2.3.2. Bố trí thí nghiệm tách chiết fucoidan theo 3 qui trình
Để khảo sát các phương pháp tách chiết hàm lượng fucoidan, thí nghiệm được bố trí tách chiết trên 3 loài rong S.mcclurei, S.polycystum, S.oligocystum theo 3 qui trình như đã trình bày ở trên. Trong đó, KT1, KT2, KT3, KT4 là kết quả tách chiết lần lượt theo qui trình của Viện nghiên cứu và Ứng dụng công nghệ Nha Trang, theo bản quyền WO2005014657, theo bản quyền EP0645143A1. Mỗi mẫu thí nghiệm sử dụng 1kg rong khô hoặc 7,7 kg rong tươi (tùy theo qui trình) để thu nhận fucoidan. Các mẫu thí nghiệm đều lặp lại 3 lần, kết quả trung bình chung giữa các lần thí nghiệm. Sau khi thu nhận fucoidan tiến hành sấy khô đến trọng lượng không đổi và cân định lượng hàm lượng fucoidan thô. Sau đó, tiến hành định lượng fucoidan tinh khiết trong sản phẩm thô bằng phương pháp định lượng fucoidan chính xác nhất ở phần trên và tính hiệu suất thu nhận fucoidan tinh khiết.
Hình 2.3. Bố trí thí nghiệm tách chiết fucoidan theo 3 qui trình
1kg rong khô + 10 lít nước, pH=2, nhiệt độ phòng, ngâm chiết 24 giờ, thỉnh thoảng khuấy trộn, lọc bỏ bã rong, thu dung dịch 1 kg rong + 3 lít nước, pH=2 1000C, 60 phút, lọc bỏ bã rong, thu dung dịch 1 kg rong + 3 lít nước, 1000C, 60 phút 7,7 kg rong tươi + 7,7 lít ethanol, 500C, 22 giờ, lọc lấy bã rong, ngâm 10 lít nước, pH=2, nhiệt độ phòng, khuấy trộn 12 giờ, lọc bỏ bã rong, thu dung
dịch
Lọc rây phân tử 100kDa loại bỏ nước muối và các tạp chất MW<100kDa, đến thể tích còn lại khoảng 1/10 thể tích dịch lọc ban đầu, thêm 10 lít nước cất, chạy lọc rây tiếp tục đến khi thể tích trên rây còn lại 1 lít. Trung hòa. Thêm vào mỗi dịch lọc 2 lít ethanol 96% (v/v). Ly tâm, bỏ dịch ly tâm thu kết tủa. Sấy khô hoặc phơi
khô tự nhiên. KT1 KT2 KT3 KT4 + CaCl2 đạt 0,5 đến 1g/l. Ly tâm loại bỏ alginate thu dung dịch.
2.2.3.3. Bố trí thí nghiệm xây dựng qui trình cải tiến thu nhận fucoidan từ rong nâu
Năm 2008, Peggy Vauchel đã đưa ra một phương pháp mới để chiết alginate từ rong nâu [52]. Rong được xay chiết trong dung dịch kiềm để thu dịch alginate, rong nâu chỉ cần đi qua chiều dài một ống kim loại có lắp 2 trục xoắn xoay ngược chiều nhau thời gian từ 5 đến 10 phút thì sau khi qua khỏi ống rong đã được phá hủy màng tế bào và alginate đã được đưa vào dịch xay chiết. Phân bố fucoidan trong rong nâu là nằm xen lẫn với alginate trong thành tế bào, vì vậy việc alginate bị phá hủy đưa ra cũng tương đồng với việc fucoidan cũng bị đưa ra theo dịch chiết. Từ suy luận này, một thiết bị được thiết kế như một máy xay có gia nhiệt, tốc độ quay của dao là 14.000 vòng/phút, nhiệt độ thay đổi từ nhiệt độ phòng đến 1000C. Đây là thiết bị đã được chế tạo cố định, vì vậy không tiến hành khảo sát các vấn đề thuộc về chế tạo thiết bị trong đề tài này.
Qui trình xay chiết mới được xây dựng dựa trên việc tối ưu hóa một trong các quy trình cho hiệu suất chiết cao nhất ở phần 2.2.3.2, trên loài rong cho hàm lượng fucoidan cao nhất. Đồng thời cải tiến thêm công đoạn xay chiết. Vì trong các bản quyền lựa chọn không có công đoạn xay. Nếu quá trình chiết chỉ nâng nhiệt, thì đòi hỏi nhiệt độ phải cao làm ảnh hưởng hoạt tính của fucoidan, nếu bổ sung công đoạn xay cùng với nâng nhiệt trong quá trình chiết, các hoạt chất thoát ra nhanh hơn, dễ dàng hơn, giữ được hoạt tính và thu được hiệu suất fucoidan cao.
Các yếu tố khác để xem xét tối ưu hóa qui trình sẽ được tập trung tài liệu, phân tích trên phần mềm Excel và Mode 5.0 và bố trí thí nghiệm tương thích và kết quả thu được thể hiện ở phần kết quả và thảo luận.
* Bố trí thí nghiệm tối ưu hóa công đoạn xay rong nâu trong phương pháp
tách chiết fucoidan
Phân tích:
+ Công đoạn xay rong nâu tiến hành như sau: rong nâu sau khi phân loại, rửa sạch cho vào thiết bị xay với nhiệt độ, thời gian, pH nhất định.
+ Công đoạn xay là một công đoạn quan trọng trong quy trình sản xuất fucoidan từ rong nâu, nó ảnh hưởng lớn đến hiệu suất và hoạt tính fucoidan thu được sau này.
Vì vậy trong công đoạn xay rong, điều kiện tối ưu cần được tìm sao cho sản lượng fucoidan thu được sau này là cao nhất. Khi tiến hành các thí nghiệm để tìm điều kiện tối ưu cho công đoạn xay chỉ được thay đổi điều kiện thí nghiệm trong công đoạn xay, các công đoạn còn lại thì tiến hành trong điều kiện không đổi:
trải qua quá trình công nghệ
(cố định các thông số)
Theo công bố của W.A.P. Black (1952), fucoidan được tách chiết ở nhiệt độ, thời gian, pH và tỉ lệ nước/rong khác nhau, cho ra lượng fucose trong dịch chiết khác nhau. Fucose là thành phần cơ bản tạo thành phân tử fucoidan. Từ hàm lượng fucose khảo sát sự tương quan giữa các đại lượng, và rút ra được yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tách chiết fucoidan từ rong nâu [64]. Các thông số được thể hiện trong bảng 2.1.
Bảng 2.1. Ảnh hưởng của điều kiện tách chiết đến hiệu suất tách fucoidan theo
Black (1952) Nhiệt độ (0C) Thời gian (giờ) pH Tỉ lệ nước:rong
Hàm lượng fucose trong
dịch chiết (% so với fucose
tổng trong rong) 75 1 9,1 9,66 29,6 75 1 2,5 10,34 56,5 70 1 2,3 10 51,3 70 1 4,5 9,92 22,2 70 1 2,2 9,78 81,6 100 7 5,8 9,95 61 100 7 7 19,69 67,8 100 15 7 19,59 77,6 100 7 7 19,62 68,7
Phân tích tương quan bằng MS Excel, chọn tool, Data Analysis, Correlation thu được kết quả trong bảng 2.2.
Bảng 2.2. Kết quả phân tích tương quan giữa điều kiện và hiệu suất chiết fucoidan
Nhiệt độ Thời gian pH Tỷ lệ
nước:rong fucose tan
Nhiệt độ 1
Thời gian 0,857326 1
pH 0,593122 0,492753 1
Tỷ lệ nước:rong 0,784723 0,783984 0,498483 1
fucose tan 0,507478 0,550514 -0,14395 0,521729 1
Rong nâu sau khi phân
Do các yếu tố nhiệt độ, thời gian, pH, tỉ lệ nước/rong là con số đã có và đã biết trước, vì vậy chỉ quan tâm đến tương quan giữa các yếu tố này với hàm lượng fucose tan trong dịch chiết, tức là hiệu suất chiết fucoidan. Từ kết quả cho thấy đại lượng nhiệt độ, thời gian, tỉ lệ nước/rong ảnh hưởng tương quan thuận gần như ngang nhau đối với hiệu suất chiết, riêng pH tương quan ngược và không ảnh hưởng lắm.
Mặc dù yếu tố tỉ lệ rong/nước ảnh hưởng đến hiệu suất chiết hơn là pH, nhưng số liệu trên chỉ xét đến sự có mặt của fucose trong dịch chiết, cần phải xét đến yếu tố thu hồi fucoidan từ dịch chiết, vì vậy tỉ lệ rong : nước được cố định là 1: 15, với tỉ lệ này, việc lọc sạch dịch chiết là thuận lợi nhất, chủ yếu của chọn lựa này là để xay được rong trong thùng xay dễ dàng, đồng thời lọc được dịch qua vải lọc và ép hết ra khỏi bã. Như vậy các yếu tố còn lại cần khảo sát để tìm điều kiện tối ưu là pH, nhiệt độ và thời gian.
Từ cơ sở dữ liệu trên bảng 2.1 trích được bảng biểu diễn hiệu suất liên hệ với nhiệt độ, thời gian và pH. Các thông số được thể hiện trong bảng 2.3.
Bảng 2.3. Bảng biểu diễn hiệu suất liên hệ với nhiệt độ, thời gian và pH
Nhiệt độ (0C) [T]
Thời gian (giờ)
[t]
pH [p]
Hiệu suất chiết
[H] 75 1 9,1 29,6 75 1 2,5 56,5 70 1 2,3 51,3 70 1 4,5 22,2 70 1 2,2 81,6 100 7 5,8 61 100 7 7 67,8 100 15 7 77,6 100 7 7 68,7
Bảng 2.4. Bảng biểu diễn hiệu suất liên hệ với nhiệt độ, thời gian và pH với một loài rong khác
Nhiệt độ (0C) [T]
Thời gian (giờ)
[t]
pH [p]
Hiệu suất chiết
[H]
15 6 1,5 19,8
70 1 2,7 49,6
Mục tiêu của đề tài là xây dựng qui trình chiết fucoidan có hiệu suất cao nhất. Vì vậy các thông số nhiệt độ, thời gian, pH cho hiệu suất cao hơn 60% được sử dụng để triển khai phân tích tương quan với mục đích tìm được tương quan tuyến tính và quan hệ giữa các đại lượng chính xác khi thử lại trên phương trình. Các thông số được thể hiện trên bảng 2.5.
Bảng 2.5. Bảng biểu diễn nhiệt độ, thời gian và pH cho hiệu suất fucoidan cao hơn 60%
Nhiệt độ (0C) [T]
Thời gian (giờ)
[t]
pH [p]
Hiệu suất chiết
[H] 70 1 2,2 81,6 100 7 5,8 61 100 7 7 67,8 100 15 7 77,6 100 7 7 68,7
Giải quyết bài toán tối ưu tiếp tục bằng solver của Excel hoặc các phần mềm khác sẽ tìm được các giá trị cần thiết của các yếu tố nhiệt độ, thời gian, pH. Tuy nhiên, trong điều kiện có sẵn của phòng thí nghiệm và trên thiết bị qui mô pilot, điều kiện thí nghiệm chỉ có thể có những biến đổi sau :
- Nhiệt độ từ 500C đến 900C. - Thời gian từ 10 phút đến 50 phút. - pH từ 8 đến 14.
Trong đó:
+ Nhiệt độ biến đổi 50C theo điều khiển nhiệt của thiết bị.
+ pH thay đổi với bước nhảy là 1 theo các hóa chất thông dụng được đưa vào (9, 12, 14: NaHCO3, Na2CO3, NaOH).
+ Thời gian có bước nhảy là 10 phút
Theo công bố của Nora M.A. Ponce (2003) đã chứng tỏ chiết rong với nhiệt độ quá thấp thì đối với rong không xay nát, sẽ không có mặt alginate trong dịch chiết. Với điều kiện nhiệt độ đó, việc tinh sạch fucoidan có thể dễ dàng hơn, tuy nhiên alginate