3.1. Đối tƣợng và thời gian nghiên cứu 3.1.1. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu 3.1.1. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu
Vật liệu:
Dòng nhị bội: TN2, TN3, TN4, TN5, TN6, TN7, TN8, TN9, 2X-B. Dòng tam bội: XB-130, XB-102, XB-108, XB-107, XB-106, XB-103, XB-110.
Dòng tứ bội: XB-1, XB-2 .
Đề tài nghiên cứu trên vườn cây 5 năm tuổi, được nhân bằng phương pháp chiết, bắt đầu ra hoa và đậu quả trồng tại Thái Nguyên.
3.1.2. Thời gian nghiên cứu
Đề tài được tiến hành từ tháng 10/2008 đến tháng 7/2010
3.2. Nội dung và phƣơng pháp nghiên cứu
Nội dung 1: Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của các dòng cam quýt.
Phƣơng pháp nghiên cứu:
Nghiên cứu đặc điểm hình thái: Theo phương pháp nghiên cứu sinh học cây cam quýt của Đại học tổng hợp Kyushu Nhật Bản kết hợp với qui phạm khảo nghiệm giống cam quýt của Bộ NN và PTNT (1100TTCCNN--22000077)).. Mỗi dòng nghiên cứu trên 5 cây, theo dõi các chỉ tiêu:
Đánh giá hình dạng tán.
Chiều cao cây (chiều cao tính từ mặt đất đến đỉnh tán cây).
Đường kính tán (đo đường kính tán theo hai chiều đông-tây và nam - bắc tính trung bình).
Độ phân cành: (tính số lượng cành cấp I và cánh cấp II, tỷ lệ cành cấp II/cành cấp I).
Mật độ gai (đánh giá mật độ gai theo chỉ tiêu: thưa, trung bình, dày...), hình thái lá (đo đếm chiều dài, rộng của lá và eo lá, đảm bảo số mẫu nghiên cứu n ≥ 30).
Nghiên cứu đặc điểm sinh trưởng: Mỗi dòng nghiên cứu trên 5 cây,
trên mỗi cây chọn 5 - 6 cành ngang tán, đều về 4 phía, chọn cành có đường kính từ 1,5 - 2,0 cm, đảm bảo số cành theo dõi n ≥ 30, tiến hành đánh dấu cành ở phần sát với thân chính, theo dõi tình hình ra lộc, sinh trưởng của lộc trên cành thí nghiệm từ phần đánh dấu trở lên. Khi lộc ra tiến hành đánh dấu lộc, trong đó ghi rõ ngày tháng ra lộc, các đợt lộc ra trên cành thí nghiệm được theo dõi liên tục trong suốt thời gian thí nghiệm.
Các chỉ tiêu theo dõi
Đặc điểm hình thái gồm các chỉ tiêu theo dõi như sau: Đánh giá hình dạng tán
Đường kính gốc Chiều cao cây Đường kính tán Độ phân cành Mật độ gai Hình thái lá
Nội dung 2: Nghiên cứu khả năng tạo đa bội từ mầm hạt cam quýt Thí nghiệm 1: Nghiên cứu ảnh hƣởng của xử lý Chochicine và thời gian đến khả năng tạo tứ bội ở camquýt
Vật liệu: dòng TN4 và TN9
Chọn ngẫu nhiên 30 hạt đã bóc vỏ cho một công thức. Đảm bảo số hạt được chọn phải đồng đều, chọn hạt vừa phải.
Công thức thí nghiệm
Mầm hạt được xử lý cholchicine với các thời gian (6h; 12h) ở các nồng độ (0,005%; 0,01%; 0,02%). Các thời gian ( 6h; 12h; 24h; 48h) ở 3 nồng độ khác nhau ( 0,05%; 0,1%; 0,2%), và 2 công thức đối chứng ở 0% cho 2 dòng.
Phƣơng pháp nghiên cứu
Pha dung dịch mẹ: Hoà tan 0,4g cholchicine vào trong 196 ml nước cất tạo 200ml dung dịch mẹ 0,2%. Dung dịch này để trong bóng tối. Từ dung dịch mẹ pha loãng ra các nồng độ cần dùng: 0,05%; 0,1%; 0,2%.
Hạt đã bóc vỏ được gieo trong hộp nhựa trải giấy thấm nước, để ở nhiệt độ 250C sau 3 ngày hai lá mầm bắt đầu mở thì tiến hành xử lý cholchicine.
Hạt được gieo trong các đĩa Petri trải giấy thấm mỏng, nhúng ngập hạt trong dung dịch sau đó dùng giấy bạc bọc kín đĩa Petri để tránh dung dịch bốc hơi. Đưa trên máy lắc lắc nhẹ 20 - 40 vòng / phút.
Sau các thời gian thí nghiệm, hạt được lấy ra khỏi đĩa và được rửa sạch bằng nước cất nhiều lần (3 - 5 lần), gieo trên đĩa Petri có đặt giấy thấm và ổn định ẩm độ 100%.
Sau 1 - 2 tuần hạt nảy mầm đưa trồng trong bầu đất 12cm x 6cm. Sau khi cây mọc từ 2 - 4 tuần tiến hành đánh giá kết quả xử lý:
Các chỉ tiêu theo dõi:
Tỉ lệ sống (%) Tỉ lệ nhị bội (%). Tỉ lệ tứ bội (%)
Thí nghiệm 2: Sơ bộ đánh giá sinh trƣởng của cây con tứ bội và nhị bội sau xử lý Chochicine trong 6 tháng đầu.
Phƣơng pháp nghiên cứu
Chiều cao cây (cm): Đo từ gốc sát mặt đất lên tới đỉnh sinh trưởng của cây, đo tất cả số cây thí nghiệm (đo 1 lần / tháng).
Số lá: Đếm tổng số lá trên cây, lá được tính khi 2 phiến lá đã mở (đếm số lá 1 lần / tháng).
Các chỉ tiêu theo dõi
Động thái tăng trưởng chiều cao. Động thái ra lá.
Nội dung 3: Nghiên cứu khả năng tạo thể đa bội từlai hữu tính Phƣơng pháp nghiên cứu:
Thu hạt và chuẩn bị mẫu thí nghiệm: Khi quả chín, tiến hành hái quả và thu hạt bao gồm cả hạt có lá mầm hoàn thiện (hạt mẩy – perfect seeds) và hạt có lá mầm không hoàn thiện (imperfect seeds). Tiến hành bóc vỏ hạt, gieo hạt trên giấy thấm để trong hộp nhựa, đảm bảo giữ ở độ ẩm bão hòa. Hạt được gieo trong điều kiện phòng thí nghiêm (25°C) có chiểu sáng . Sau khoảng 1 tuần, khi hạt nẩy mầm và đầu mút rễ dài hơn 1 cm, thu đầu mút rễ để làm mẫu quan sát NST . Mầm hạt sau khi thu đầu mút rễ , được đánh dấu và tiếp tục chăm sóc trong điều kiện tương tự thêm một thời gian để mầm sinh trưởng khỏe, sau đó gieo mầm trong bầu đất và chăm sóc để mầm phát triển thành con lai phục vụ cho giai đoạn chọn lọc tiếp theo.
Phƣơng pháp quan sát NST: Quan sát NST theo phương pháp của Park S. M. [34]. Sử dụng các đầu mút rễ non của hạt lai sau khi được gieo trên bầu đất hoặc gieo trên đĩa Petri trong vòng 10 ngày, rễ dài hơn 1cm.
Đầu mút rễ sau khi thu nhận được xử lý trong 2m M 8-hydroxyquinoline trong điều kiện nhiệt độ 70C trong vòng từ 24-26 giờ. Sau đó chuyển mẫu sang dung dịch Ethel etanol – Acetic acid (3:1.. v/v) ở nhiệt độ phòng trong
12 giờ (chưa xử dụng ngay chuyển mẫu sang ethanol 90% và bảo quản ở nhiệt độ 4-5 độ C).
Sau đó, rửa sạch mẫu bằng nước cất, sau đó đưa mẫu ngập trong dung dịch hỗn hợp enzyme từ 90-210 phút ở 37 độ C.
Thành phần hỗn hợp enzym gồm: cellulase 4% (ONOZUKA hoặc Yakult), Pectolyase 1% (Y23) (Seishin Pharmarceutical), 0,07 M KCL, 0,075M Na2 EDTA. Trước khi xử lý, hỗn hợp enzym được điều chỉnh pH = 4 bằng HCL 0,1 M. Sau đó, rửa sạch mẫu bằng nước cất trước khi đưa mẫu lên lam kính cùng vài giọt Ethel etanol – Acetic acid (3:1.. v/v). Nhẹ nhàng tán mẫu trên lam kính, để khô trong điều kiện thường, mẫu trên lam kinh được nhuộm bằng Giemsa 4% trong 30 phút. Thành phần dung dich nhuộm: 4% Giemsa hòa loãng trong dung địch đệm phot phat, pH = 6.8.
Mẫu được để khô trên lam kính rồi quan sát NST trên kính hiển vi quang học NIKON Eclispe – E100, có gắn máy ảnh tự động. Nhiễm sắc thể của từng mẫu được quan sát và đếm số lượng NST của từng con lai.
Kiểm tra con lai F1 ở các cặp lai
Cặp lai 2x (dòng 2xB) 2x (dòng TN7) Cặp lai 2x (dòng TN5) 3x (dòng XB-106) Cặp lai 2x (dòng TN8) 3x (dòng XB-106)
Các chỉ tiêu theo dõi
Tỉ lệ nhị bội (%) Tỉ lệ tam bội (%) Tỉ lệ tứ bội (%) Tỉ lệ dị bội (%)
3.3. Xử lí số liệu
Số liệu được xử lý bằng các phần mềm IRISTART và các phương pháp thống kê thông thường.
PHẦN IV