Enzyme là những protein có khả năng xúc tác sinh học chỉ cần một lượng nhỏ cũng có thể xúc tác để chuyển một lượng cơ chất rất lớn thành sản phẩm.
Enzyme là chất hữu cơ có phân tử lượng lớn từ 20.000 đến 1.000.000 dalton. Do vậy, enzyme không thể đi qua được màng bán thấm. Giống như các protein, enzyme có thể hòa tan trong nước, trong dung dịch muối loãng, trong các dung môi hữu cơ có cực, không hòa tan trong dung môi không phân cực. Và khi tan trong nước thì tạo thành dung dịch keo giống như dung dịch của protein.
Enzyme bị kết tủa bởi các yếu tố gây kết tủa protein. Các yếu tố vật lý và hóa học làm kết tủa protein thì cũng làm kết tủa enzyme. Enzyme cũng bị mất hoạt tính
khi bị tác động của các yếu tố gây biến tính protein như nhiệt độ cao, acid hoặc kiềm đặc, muối kim loại nặng…
Enzyme có hai loại: enzyme một thành phần và enzyme hai thành phần. + Enzyme một thành phần thì trong thành phần của nó chỉ có protein, những enzyme này thường xúc tác cho các phản ứng thủy phân.
+ Enzyme hai thành phần gồm có: phần protein và phần phi protein. Phần protein gọi là apoenzyme, phần phi protein gọi là coenzyme.
Đến nay người ta đã xác định được rằng phần lớn enzyme trong tế bào đều có cấu trúc bậc bốn bao gồm nhiều tiểu đơn vị, các tiểu đơn vị này có thể liên kết với nhau bằng liên kết hydro, liên kết cộng hóa trị và một số liên kết khác, tùy mức độ liên kết mà hình thành các đồng phân của enzyme gọi là isoenzyme.
Trung tâm hoạt động của phân tử enzyme: chỉ chiếm một tỷ lệ khá nhỏ so với phân tử enzyme và nó bao gồm nhiều nhóm chức khác nhau. Ở enzyme một cấu tử thì trung tâm hoạt động là một nhóm chức nhất định của các acid amin như SH, OH, -COOH…. Trung tâm hoạt động của enzyme hai cấu tử là do phần polypeptide kết hợp đặc biệt tham gia vào việc tạo thành trung tâm hoạt độngvà các nhóm chức của coenzyme, ngoài ra trung tâm hoạt động này còn có sự tham gia của các ion kim loại.
Hoạt tính của enzyme phụ thuộc vào tổng hợp các nhóm tham gia vào cấu trúc trung tâm hoạt động, nếu vì một lý do nào đó mà trung tâm hoạt động này bị phá vỡ thì hoạt tính xúc tác của enzyme mất đi. [3]
Proteaza là enzyme xúc tác sự thủy phân các liên kết peptit (-CO-NH-) trong phân tử protein, polypeptide đến các sản phẩm cuối cùng là các axit amin. Ngoài ra, nhiều protease cũng có khả năng thủy phân liên kết este và vận chuyển axit amin.[3] H2N – CH – CO – NH – CH – CO –…– NH – CH – COOH H2N– CH – COOH
R1 R2 RN R 1
+ H2N – CH – CO … NH – CH – COOH R2 RN
Enzyme protease được chia làm hai loại: endopeptidaza và exopeptidaza. Dựa vào vị trí tác động trên mạch polypeptide, exopeptidaza được chia làm hai loại:
Aminopeptidaza: xúc tác thủy phân liên kết peptide ở đầu N tự do của
chuỗi polypeptide để giải phóng ra một amino axit.
Cacboxypeptidaza: xúc tác thủy phân liên kết peptide ở đầu C của chuỗi polypeptide để giải phóng ra một amino axit.
Dựa vào động học của cơ chế xúc tác, endopeptidaza được chia thành 4 nhóm:
Serine proteinase: là những proteinase chứa nhóm –OH của gốc
serine trong trung tâm hoạt động và có vai trò đặc biệt quan trọng đối với hoạt động xúc tác của enzyme. Nhóm này bao gồm hai nhóm nhỏ: chymotrypsin và subtilisin. Nhóm chymotrypsin bao gồm các enzyme động vật như chymotrypsin, trypsin, elastase. Nhóm subtilisin bao gồm hai loại enzyme vi khuẩn như subtilisin, carlsberg, subtilisin BPN. Các serine proteinase thường hoạt động mạnh ở vùng kiềm tính và thể hiện tính đặc hiệu cơ chất tương đối rộng
Cysteine proteinase: các proteinase chứa nhóm –SH trong trung tâm
hoạt động. Cysteine proteinase bao gồm các proteinase thực vật như papain, bromelin, một vài protein động vật và proteinase ký sinh trùng. Các Cysteine proteinase thường hoạt động ở vùng pH trung tính, có tính đặc hiệu cơ chất rộng.
Aspartic proteinase: hầu hết các aspartic proteinase thuộc nhóm
pepsin, nhóm pepsin bao gồm các enzyme tiêu hóa như: pepsin, chymosin, cathepsin, renin. Các aspartic proteinase có chứa nhóm carboxyl trong trung tâm hoạt động và thường hoạt động mạnh ở pH trung tính.
Metallo proteinase: là nhóm proteinase được tìm thấy ở vi khuẩn, nấm
mốc cũng như các sinh vật bậc cao hơn. Các metallo proteinase thường hoạt động vùng pH trung tính và hoạt độ giảm mạnh dưới tác dụng của EDTA.
Ngoài ra, protease được phân loại một cách đơn giản hơn thành 3 nhóm:
Protease trung tính: pH = 7 – 8
Protease kiềm: pH = 9 – 11. [3]
1.2.3 Cơ chế xúc tác của enzyme
Quá trình tạo thành phức hợp enzyme cơ chất và cự biến đổi của phức hợp này thành sản phẩm, giải phóng enzyme tự do thường trải qua ba giai đoạn theo sơ đồ sau:
E + S ES P + E Trong đó:
E: enzyme S: cơ chất
ES: phức hợp enzyme – cơ chất P: Sản phẩm
Giai đoạn 1: enzyme kết hợp với cơ chất bằng liên kết yếu tạo thành
phức hợp enzyme – cơ chất (ES) không bền, phản ứng này xảy ra rất nhanh và đòi hỏi năng lượng hoạt hóa thấp. Các loại liên kết chủ yếu được tạo thành giữa E và S trong phức hợp ES là: tương tác tĩnh điện, liên kết hydrogen, tương tác Van der Waals.
Giai đoạn 2: xảy ra sự biến đổi cơ chất dẫn tới sự kéo căng và phá vỡ
các liên kết đồng hóa trị tham gia phản ứng.
Giai đoạn 3: tạo thành sản phẩm, còn enzyme được giải phóng ra dưới dạng tự do. [9]
1.2.4 Ứng dụng của enzyme
Enzyme protease được ứng dụng rộng rãi trong nhiều ngành công nghiệp thực phẩm, công nghiệp nhẹ, công nghiệp dược, nông nghiệp…
Trong công nghiệp thịt, protease được dùng để làm mềm thịt nhờ sự thủy phân một phần potein trong thịt, làm cho thịt có một độ mềm thích hợp và tăng hương vị cho thịt. Các loại protease thường dùng: protease thực vật (papain, bromelin, fixin) và protease vi sinh vật (từ nấm mốc, xạ khuẩn).
Trong công nghiệp sữa, protease được dùng để sản xuất phomat nhờ hoạt tính làm đông tụ sữa của chúng. Có thể dùng renin, pepsin, một số protease vi sinh vật có hoạt tính làm đông tụ sữa được tách từ nấm mốc hoặc vi khuẩn.
Trong công nghiệp da, protease được sử dụng với mục đích tách lông trên da và làm mềm da nhờ sự thủy phân sơ bộ lông, tách các mô liên kết phía ngoài ra, chỉ còn một lớp collagen tạo lớp mỏng và mềm da.
Trong công nghiệp dệt: protease được sử dụng để xử lý bên ngoài các sợi tơ, làm nhiệm vụ kết dính các sợi tơ. Protease có tác dụng thủy phân lớp protein, serisin đã làm dính bết các sợi tơ tự nhiên, làm bong và tách rời các loại tơ tằm do đó làm giảm lượng hóa chất để tẩy trắng.
Trong chế biến thủy sản, tăng lượng nước mắm nhờ thủy phân protein thành các acid amin làm tăng hiệu suất thu hồi đạm của nước mắm.
Một số ứng dụng khác:
- Điều chế các dịch đạm thủy phân dùng làm chất dinh dưỡng, chất điều vị trong thực phẩm và bổ sung cho thức ăn gia súc. Từ Streptomyces fradiae tách được chế phẩm keratineza thủy phân được keratin rất có giá trị để sản xuất bột đạm từ da, lông vũ.
- Điều chế môi trường dinh dưỡng của vi sinh vật để sản xuất vacsin, kháng sinh…
- Sản xuất keo động vật, chất giặt tổng hợp để tẩy các chất bẩn protein, sản xuất mỹ phẩm.
- Sản xuất thuốc hỗ trợ tiêu hóa, nấu cao động vật, như bệnh nghẽn mạch máu, tiêu viêm vết thương. [3]
1.3 Thủy phân protein
Thủy phân protein là một giải pháp để tăng giá trị của các phế liệu trong chế biến thủy sản. Thuỷ phân protein bằng con đường hoá học hoặc con đường enzyme có thể cho ra đa dạng sản phẩm.
1.3.1 Thủy phân hóa học
Thuỷ phân hoá học là phương pháp cổ điển. Thuỷ phân có thể thực hiện trong môi trường acid (HCl hoặc H2SO4) hoặc trong môi trường kiềm (NaOH). Điều kiện thuỷ phân khá tốn kém: nhiệt độ cao (1000C) và thường là trong môi trường áp suất thấp.
Thuỷ phân axit có bất lợi là phá huỷ một phần axit amin và đặc biệt là phá huỷ hoàn toàn tryptophane. Cho nên cần thiết bổ sung vào dịch thuỷ phân những axit amin này.
Thuỷ phân trong môi trường kiềm bằng xút sẽ phá huỷ cystein, cystine, arginin và methionin. Đặc biệt, thuỷ phân trong môi trường kiềm là nguyên nhân gây ra sự chuyển đổi L-axit amin thành D-axit amin con người không hấp thụ được, điều này làm giảm giá trị dinh dưỡng của sản phẩm.
1.3.2 Thủy phân enzyme
Thuỷ phân enzyme có thuận lợi là dễ kiểm tra hơn thuỷ phân hoá học, cho phép giữ giá trị dinh dưỡng của nguyên liệu ban đầu và không cần xử lý hoá học để loại bỏ tác nhân thuỷ phân sau khi thuỷ phân (enzyme dễ dàng bị bất hoạt bởi nhiệt độ tương đối).
Trong thuỷ phân enzyme, những proteasa sẽ cắt liên kết peptit của 2 axit amin kế tiếp nhau trong đoạn ban đầu của protein tạo thành ít nhất 2 peptit. Cắt đứt liên kết peptit sẽ giải phóng proton H+. Sự giải phóng này sẽ làm cho môi trường có tính axit. Quy luật này buộc quá trình thuỷ phân xảy ra trong điều kiện pH môi trường lớn hơn 6.5 để cho mức độ điện li của ion -R-N+H3 được đủ. Khi pH nhỏ hơn thì phản ứng xảy ra theo chiều ngược lại và do đó ion OH- được giải phóng. [6]
OH2 H R1 O N H R2 H ... ... H R1 O O ... H N+ H H H R2 ... H N+ H H H R2 ... H N H+ H H R2 ... + enzyme + +
Sự khác nhau trong quá trình chuẩn bị thuỷ phân chính là nguồn gốc enzyme thương mại (enzyme ngoại bào), được thêm vào trong quá trình chuẩn bị để thúc đẩy quá trình thuỷ phân. Quá trình thuỷ phân được thúc đẩy bằng một enzyme duy nhất hay hỗn hợp proteasa thương mại có rất nhiều thuận lợi như kiểm tra được quá trình thuỷ phân và thông số thuỷ phân và sử dụng nhiệt độ xúc tác tương đối.
Những enzyme được sử dụng có thể chia thành 3 dạng :
1. Enzyme có nguồn gốc thực vật : papain (quả đu đủ), ficin (cây vả), bromelin (quả dứa).
2. Enzye có nguồn gốc động vật : trypsin, chymotrypsin, pepsin (thành dạ dày). 3. Enzyme có nguồn gốc vi sinh vật : pronase (streptomyces griseus), protamex,
monzym (bacillus subtilis) ...
1.3.3 Sản phẩm thủy phân1.3.3.1 Dịch đạm thủy phân 1.3.3.1 Dịch đạm thủy phân
Dịch đạm thủy phân là sản phẩm của quá trình thủy phân. Khi cô đặc thì chúng sẽ thành dịch đạm cô đặc.
Thành phần chủ yếu của dịch đạm thủy phân là các axit amin, các peptit. Ngoài ra, trong dịch đạm thủy phân còn chứa một lượng nhỏ khoáng và lipit.
1.3.3.2 Bột đạm thủy phân
Bột đạm thủy phân cũng là một trong những dạng của quá trình thủy phân. Dịch đạm thủy phân được đem đi cô đặc và sấy khô thì thu được bột đạm thủy phân (bột đạm hòa tan). Thực chất của quá trình sản xuất bột đạm bằng phương pháp sử dụng protease là quá trình thủy phân protein để tạo các peptit và các axit amin dưới tác động của hệ protease nội tại và enzyme bổ sung từ ngoài vào.
Bột đạm thủy phân có hàm lượng protein cao khoảng 70%, lipid khoảng 0,5% và tỷ lệ nitơ dễ hấp thụ cao, rất có giá trị dinh dưỡng. Có thể sử dụng dưới dạng nguyên chất hoặc phối trộn với các thực phẩm khác.
Bột đạm thủy phân có màu trắng ngà, vàng nhạt hay vàng nâu tùy thuộc vào nguyên liệu ban đầu. Mùi thơm đặc trưng, khi cho vào nước dễ tan, có khả năng tạo gel, dẻo dính.
Bột đạm thủy phân thường được sản xuất từ các loài cá kém giá trị kinh tế hoặc từ các phế liệu cá.
1.3.3.3 Các sản phẩm phụ từ quá trình thủy phân
Bột cặn thủy phân (protein không tan): là lớp dưới cùng sau khi ly tâm dịch thủy phân, được đem đi sấy khô và xay nghiền. Trong bột cặn chứa phần lớn là protein không tan.
Bột khoáng là phần xương thu được sau quá trình thủy phân được đem đi lọc tách xương và rửa sạch. Sau đó, bột đem đi sấy khô và xay nghiền. Trong bột khoáng có chứa các nguyên tố Ca, Mg, P…, một lượng nhỏ protein, lipit chưa thủy phân triệt để.
Dầu cá: là lớp trên cùng thu được sau khi ly tâm hỗn hợp có được từ sự thủy phân. Hàm lượng thì phụ thuộc vào nguyên liệu ban đầu. Ngoài ra, trong dầu cá có chứa hàm lượng DHA, EPA… rất tốt cho sức khỏe con người.
1.3.3.4 Ứng dụng của sản phẩm thủy phân
Dịch đạm cô đặc và bột đạm hòa tan có thể được ứng dụng trong sản xuất thức ăn chăn nuôi, đặc biệt là trong nuôi trồng thủy sản. Sản phẩm với nồng độ đạm cao, gồm hỗn hợp các amin cần thiết cho sự phát triển của tôm, cá. Sản phẩm cũng chứa các chất kích thích tiêu hóa. Cho nên khi phối trộn chúng vào thức ăn theo tỷ lệ phù hợp sẽ làm tăng vị ngon và với mùi hấp dẫn sẽ giúp cho tôm, cá nhanh chóng phát hiện và ăn mồi, góp phần cung cấp lượng thức ăn đầu vào cho nuôi trồng thủy sản.
Bột đạm thủy phân cũng có thể được dùng trong thực phẩm sản xuất các sản phẩm bột dinh dưỡng cao đạm đối với bột đạm thủy phân có chất lượng cao. Ngoài ra thì nó cũng có thể sử dụng làm phụ gia, gia vị trong thực phẩm.
Dịch đạm cô đặc còn có thể sử dụng để bổ sung trong quá trình làm nước mắm do nó có hàm lượng axit amin cao, làm tăng độ đạm của nước mắm.
Dịch đạm thủy phân có thể dùng trong sản xuất nước mắm công nghiệp khi thêm hương vị của nước mắm, rút ngắn thời gian sản xuất mà hàm lượng đạm axit amin trong đó lại cao. [1]
1.3.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động của enzyme trong quá trình thủy phân phân
1.3.4.1 Ảnh hưởng của nồng độ enzyme và cơ chất
Giống như các phản ứng enzyme, tốc độ phản ứng thủy phân tỷ lệ với nồng độ enzyme. Khi nồng độ enzyme quá cao, nếu tiếp tục thêm enzyme thì sự biến đổi của tốc độ thủy phân là không đáng kể. Vì vậy, tốt hơn là sử dụng nồng độ enzyme thích hợp để đạt hiệu quả thủy phân cực đại và giảm giá thành.
Trong các phản ứng do enzyme xúc tác trước hết tạo thành phức trung gian giữa enzyme và cơ chất. Sau đó, phức này chuyển hóa tiếp tục tạo thành sản phẩm cuối cùng và enzyme tự do, enzyme lại kết hợp với phân tử cơ chất khác. Nếu nồng độ cơ chất đủ thích hợp với lượng enzyme sẽ làm cho quá trình thủy phân diễn ra đều đặn nhanh chóng. [3]
1.3.4.2Ảnh hưởng của các chất kìm hãm và các chất hoạt hóa
Chất kìm hãm hay còn gọi là các chất ức chế là những chất mà khi trong phản ứng có sự hiện diện của chúng, enzyme có thể bị giảm hoặc mất hoạt tính. Các chất này có thể là các ion, các phân tử vô cơ, hữu cơ. Các chất kìm hãm thuận nghịch hoặc không thuận nghịch, cạnh tranh hoặc không cạnh tranh. Với mỗi enzyme ta có các chất kìm hãm khác nhau.
Các chất hoạt hóa là những chất có tác dụng làm tăng tính hoạt tính enzyme. Các chất này có bản chất hóa học khác nhau, có thể là ion kim loại, anion hoặc các chất hữu cơ. [3]
1.3.4.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ
Vì enzyme có bản chất protein nên khi tăng hay giảm nhiệt độ đều ảnh hưởng đến hoạt động của enzyme. Thật vậy, mỗi enzyme chỉ hoạt động trong vùng nhiệt độ xác định. Phần lớn enzyme hoạt động thích hợp ở khoảng nhiệt độ 40 oC ÷ 50oC và vô hoạt hóa ở 70oC. Trong vùng nhiệt độ thích hợp nếu nhiệt độ tăng 10oC thì tốc độ thủy phân tăng 1,5 ÷ 2 lần. Nhiệt độ thích hợp của enzyme có thể thay đổi khi có sự thay đổi về pH, cơ chất. [3]
Enzyme rất nhạy cảm với sự thay đổi pH môi trường. Mỗi enzyme chỉ hoạt động ở vùng pH nhất định gọi là pH tối thích. pH tối thích của đa số enzyme nằm trong