3. Nội dung nghiên cứu
1.3.1.Các RNA ức chế nhỏ (siRNA và miRNA)
siRNA đƣợc tạo thành do sự phân cắt các dsRNA bởi Dicer, đây là phần tử mấu chốt của cơ chế bất hoạt gen RNAi. Cấu trúc nguyên vẹn của phân tử siRNA rất quan trọng cho tính đặc hiệu của quá trình RNAi. Hai mạch của sợi kép siRNA khác nhau về độ bền với nhiệt độ cuối cùng, một thuộc tính để nhận biết sợi đơn cần thiết trong siRNA sẽ đi vào phức hệ RISC. Sự giãn xoắn của siRNA tạo ra sợi dẫn đầu (guide strand) sẽ đi vào phức hệ RISC và liên kết với mRNA đích đặc hiệu bởi sự bổ sung trình tự tƣơng đồng. Sợi còn lại của đƣợc gọi là “sợi chờ” (passenger strand) và sẽ bị phân hủy sau đó. Do đó sợi dẫn đầu siRNA phải tƣơng tác với một số protein
liên quan trong quá trình RNAi từ khi đƣợc tạo ra cho đến lúc nhận biết mRNA đích.
Phân tử siRNA đƣợc tạo thành dài khoảng 21 – 25 nucleotide mang nhóm 5’-PO4 và 3’-OH với 2 nucleotide thò ra ở đầu 3’ [13]. Sợi xuôi chiều (sense) của mạch kép siRNA dễ bị thay đổi hóa tính hơn là sợi đối chiều (antisense), sự thay đổi diễn ra ở giữa và ở phía đầu 3’ của siRNA có ảnh hƣởng chặt chẽ tới tính đặc hiệu của RNAi hơn là những thay đổi ở đầu 5’ [10].
Nhiều nghiên cứu cho thấy là sợi đối mã có hoạt động quan trọng trong phức hợp sense và RNA đích. Các nucleotide thò ra ở đầu 3’ cũng có ý nghĩa trong quá trình xử lý RNAi. Khi tăng hoặc giảm số nucleotide đầu 3’ sẽ làm giảm hiệu quả khởi động quá trình. Khi tiến hành thử thay thế nhóm 5’-PO4
bằng một nhóm chất lớn hơn nhƣ 2’-O- methyl thì kết quả ảnh hƣởng nghiêm trọng đến sợi kép siRNA khởi đầu cho chuỗi phản ứng RNAi trong cơ thể. Phát hiện này và một số quan sát khác đã làm rõ chức năng quan trọng của nhóm 5’-PO4. Sự có mặt của 5’-PO4 làm ổn định phức hệ RISC và rất quan trọng cho sự xác định bắt cặp chính xác của RISC và phân cắt dúng vị trí trên RNA đích. Nếu vắng mặt nhóm 5’-PO4, siRNA sẽ trƣợt dài theo phức hệ RISC. Nhóm 5’-PO4 có thể đƣợc tách ra khi quá trình phân cắt đang thực hiện trên RNA đích. Một sợi kép siRNA nếu thiếu hai cả hoặc một nhóm 5’-PO4 sẽ không thể khởi đầu chuỗi RNAi trong cơ thể [22]. Sự có mặt của nhóm 3’-OH cũng quan trọng nhƣng không thật sự cần thiết bởi sự thay đổi diễn ra ở đầu này không gây ảnh hƣởng nhiều đến quá trình RNAi.
Khác với siRNA, miRNA (micro-RNA) là một RNA có chiều dài 21- 24 nucleotide không mã hóa protein có sẵn trong tế bào sống và đóng vai trò điều chỉnh biểu hiện gen. miRNA đầu tiên đƣợc tìm ra có tên là lin-4do
Victor Ambros và các đồng nghiệp tại Đại học Harvard trong khi nghiên cứu sự phát triển của Caenorhabditis elegans đột biến. Họ phát hiện rằng protein LIN-14 đƣợc điều chỉnh bởi những phân tử RNA ngắn là sản phẩm tạo ra từ gen lin-4. Một đoạn RNA ban đầu gồm 61 nucleotide đƣợc tạo ra trƣớc từ gen lin 4 cho ra một một đoạn RNA có chiều dài 22 nucleotide mang trình tự bổ sung với một đoạn trình tự ở đầu 3’ UTR của mRNA đƣợc tạo ra từ gen lin- 14. Đoạn trình tự bổ sung này có khả năng ngăn chặn sự dịch mã mRNA của gen lin14. Những đoạn RNA ngắn có nguồn gốc từ gen lin 4 đƣợc gọi là micro-RNA (miRNA) (Faller & Guo, 2008).
Sự ra đời của miRNA cho thấy RNA không chỉ làm duy nhất công việc tạo ra protein. Mục đích chính của miRNA là giảm biểu hiện gen. Có nhiều loại miRNA đóng vai trò này. Ngƣời ta dự đoán có khoảng 1000 miRNA trong cơ thể ngƣời, và khoảng 500 trong chúng đã đƣợc nhận diện. Hầu hết các gen micro-RNA đƣợc tìm thấy nằm trong vùng giữa hai gen hoặc trên chiều đối mã (antisen) và có chứa đoạn khởi động gen [18]. Có khoảng 40% gen miRNA có thể nằm trên vùng intron của gen mã hóa hoặc không mã hóa protein, thậm chí có thể có cả trên vùng extron và chúng thƣờng đƣợc phiên mã bởi RNA polymerase II (Pol II) [19]. Sợi đơn RNA sau khi phiên mã mang đầu 5’-PO4 và đuôi poly A có thể dài hàng trăm thậm chí hang nghìn nucleotide sẽ uốn vòng thành cấu trúc kẹp tóc gọi là pri-miRNA (tiền miRNA) do đặc điểm cấu trúc đặc thù. Mỗi cấu trúc kẹp tóc đƣợc tạo thành có khoảng 70 nucleotide. Cấu trúc sợi đôi RNA trong cấu tạo kẹp tóc của pri- miRNA đƣợc nhận biết bởi một protein nhân đƣợc biết đến là DGCR8 (DiGeorge Syndrome Critical Region 8). Protein này sẽ kết hợp với enzyme Dosha và định hƣớng cho tiểu phần domain RNaseIII của Dosha xử lý cấu trúc kẹp tóc pri-miRNA bằng cách cắt bớt đi các nucleotide (khoảng 11 nucleotide), kết quả tạo thành pre-miRNA với 2 nucleotide thò ra tại đầu 3’.
pre-miRNA đƣợc hình thành có mang đầu 3’-OH và 5’-PO4 sẽ đi ra tế bào chất [14]. Trong tƣơng bào, cấu trúc kẹp tóc pre-miRNA đƣợc cắt bỏ vòng nối giữa đầu 3’ và 5’ bởi Dicer nhờ hoạt tính endonuclease và tạo thành miRNA sợi kép chƣa hoàn chỉnh (miRNA*) dài khoảng 22 nucleotide (Lund & Dahlberg, 2006). Do ảnh hƣởng của hiệu quả xử lý Dicer mà miRNA*
vẫn mang một trình tự vòng trên chiều dài của nó. Trong tự nhiên, sự kết cặp giữa miRNA/miRNA* cũng ảnh hƣởng đến hiệu quả phân cắt RNA đích mặc dù mỗi sợi đơn trong chúng đều có khả năng hoạt động nhƣ là các miRNA nhƣng thông thƣờng chỉ có một sợi đƣợc đi vào phức hệ RISC và tƣơng tác với RNA đích [20].
Hình 1.3: Sự tạo thành miRNA từ gen trong nhân tế bào
Sự khác biệt quan trọng giữa siRNA và miRNA thể hiện ở (i) nguồn gốc của chúng, miRNA bắt nguồn từ các locus hệ gen trong khi siRNA thƣờng bắt nguồn từ mRNA, transposon, virus hoặc DNA tạp sắc; (ii)
miRNA đƣợc chế biến từ phiên mã có thể tạo cấu trúc kẹp tóc RNA trong khi siRNA đƣợc chế biến từ RNA sợi đôi dài hoặc dạng kẹp tóc kéo dài; (iii) sợi đôi miRNA/miRNA* đƣợc tạo ra từ tiền phân tử kẹp tóc miRNA, dẫn tới tích luỹ nhiều miRNA khác nhau từ các sợi dsRNA dài này; (iv) trình tự miRNA thƣờng gần bảo thủ ở những sinh vật có quan hệ gần gũi, trong khi siRNA nội sinh hiếm khi bảo thủ (Bartel, 2004). Những sự khác nhau này là cơ sở thực tế để phân biệt và chú giải những siRNA nội sinh và miRNA mới khám phá [11].