3. Nội dung nghiên cứu
2.2.2.Phƣơng pháp tách dòng gen
a. Tinh sạch và gắn đoạn gen vào vector tách dòng pBT
- Tinh sạch sản phẩm PCR:
(1) Điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 1% và cắt lấy băng quan tâm. (2) Bổ sung dung dich đệm GB theo tỉ lệ: Vmẫu : VGB = 1 : 1 ( 1 μl tƣơng
ứng với 1 mg mẫu).
(3) Ủ ở 600C 10 phút trộn nhẹ một lần, sau khi gel tan hết ủ thêm 5 phút cho gel tan hoàn toàn.
(4) Chuyển hỗn hợp dung dịch lên cột thôi gel Qiaquick spin column, ly tâm 13000 v/p trong 1 phút. Loại bỏ dịch chảy qua cột.
(5) Bổ sung thêm 700μl WB, ly tâm 13000 v/p trong 1 phút. Loại bỏ dịch chảy qua cột.
(6) Thêm 500μl đệm rửa WB vào cột, để rửa sạch sản phẩm.Để ở nhiệt độ phòng trong 5 phút.Ly tâm 13000 v/p trong 1 phút, loại bỏ dịch chảy qua cột, ly tâm bổ sung 1 phút để loại hết dung dịch WB.
(7) Chuyển cột sang ống Eppendorf 1,5 ml . Hòa tan DNA trong 30 – 50μl H20 khử ion, để ở nhiệt độ phòng 1 phút sau đó ly tâm 13000 v/p trong 1 phút, lấy dịch.
(8) Điện di kiểm tra sản phẩm.
- Gắn đoạn gen vào vector tách dòng pBT:
Sản phẩm PCR sau khi tinh sạch đƣợc gắn vào vector tách dòng pBT để tạo plasmid tái tổ hợp mang đoạn gen quan tâm.
Hỗn hợp phản ứng đƣợc ủ 5 phút ở nhiệt độ phòng (22 – 23oC). Sau đó đặt ống dung dịch phản ứng trên đá và thực hiện quá trình biến nạp vào tế bào khả biến E. coli chủng DH5α.
Bảng 2.2. Thành phần phản ứng ghép nối gen với vector pBT STT Thành phần Thể tích (μl) 1 Sản phẩm PCR tinh sạch 5 2 Đệm T4 ligase (10X) 2 3 T4 ligase (1U/μl) 1 4 Vector pBT (30 ng/μl) 1 5 H20 khử ion 1 Tổng Tổng thể tích 10
b. Biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến E.coli DH5α - Tạo tế bào khả biến:
(1) Tế bào E.coli DH5α đƣợc cấy ra môi trƣờng LB đặc và nuôi qua đêm ở 370C.
(2) Chọn một khuẩn lạc nuôi cấy trong 5 ml LB lỏng, lắc 200 v/p, ở 370C, qua đêm.
(3) Hút 1% dịch khuẩn ở trên cho vào 50ml LB, lắc 200 v/p, ở 370C trong 2-3 giờ. Đo OD600nm đạt 0,4 - 0,6 thì chuyển dịch sang cấy ống ly tâm, để 15 phút trong đá (hoặc ở 40
C).
(4) Ly tâm 4000 v/p, ở 40C, trong 5 phút (lặp lại 3 lần, để trong đá lần thứ hai 30 phút, lần thứ ba 60 phút). Đổ dịch CaCl2, hòa tan trong 1ml
CaCl2/100ml LB ban đầu, sau đó bổ sung 15 – 20% glycerol.
(5) Chia 50μl dịch tế bào khả biến vào mỗi ống Eppendorf 2,5ml. Bảo quản tế bào khả biến trong tủ lạnh – 840
C.
- Biến nạp:
(1) Bổ sung 5μl vectơ đã gắn gen vào ống đựng tế bào khả biến đã làm tan đá và trộn nhẹ bằng tay. Hỗn hợp đƣợc ủ trong đá 30 phút.
(2) Sốc nhiệt tế bào ở 42oC trong 45 giây và chuyển ngay vào đá, để trên đá 5 phút.
(3) Bổ sung 250μl môi trƣờng LB lỏng ở nhiệt độ phòng. Hỗn hợp đƣợc nuôi lắc 200 v/p trong vòng 1 giờ ở 370
C.
(4) Sử dụng que cấy trải đã khử trùng trải 200 μl dịch khuẩn biến nạp lên đĩa LB chọn lọc chứa ampicilin 100mg/l, X- gal 30mg/l và 200 mM IPTG. (5) Nuôi ở 37oC qua đêm trong vòng 16 giờ.
c. Chọn dòng khuẩn lạc bằng colony – PCR.
Sau khi nuôi đĩa khuẩn đã biến nạp trên môi trƣờng chọn lọc, thấy xuất hiện nhiều khuẩn lạc trắng. Chọn ra một số khuẩn lạc trắng để chạy phản ứng colony – PCR với cặp mồi pUC18-F/pUC18-R nằm trên vector pBT để xác định khuẩn lạc có mang đoạn gen đã đƣa vào. Thành phần và chu kỳ nhiệt cũng giống nhƣ phản ứng PCR nhân gen mục (2.2.1),mẫu DNA đƣợc thay bằng khuẩn lạc. Sản phẩm đƣợc điện di kiểm tra trên gel agarose 0.8% để chọn ra những khuẩn lạc mang gen có kích thƣớc nhƣ mong muốn. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
d. Tách chiết plasmid tái tổ hợp
Chuẩn bị hóa chất:
- Sol II: 0,2 NaOH; SDS 1%
- Sol III: 60 ml CH3COOK 5M; 11,5 ml CH3COOH; 28,5 ml H20 Các bƣớc tiến hành:
(1) Lấy 2ml dịch khuẩn nuôi cho vào ống Eppendorf 2ml, ly tâm 8000 v/p trong 5 phút để thu cặn tế bào.
(2) Loại dịch nổi, thu cặn, sau đó bổ sung 200μl sol I(lạnh), vortex cho tan đề. (3) Bổ sung 400μl sol II, đảo nhẹ bằng cách đảo ngƣợc ống Eppendorf
khoảng 10 lần(phá vỡ màng tế bào vi khuẩn).
(4) Bổ sung 300μl sol III(lạnh), đảo nhẹ bằng cách đảo ngƣợc ống Eppendorf,sau đó ly tâm 13000 v/p trong 10 phút.
(5) Thu dịch nổi sau đó bổ sung hỗn hợp chloroform: isoamyl (24 : 1), đảo nhẹ. Ly tâm 13000 v/p trong 10 phút.
(6) Thu phần dịch nổi, hút 600μl mẫu sau đó bổ sung isopropanol lạnh theo tỉ lệ 1 : 1, sau đó để trong tủ đá.
(7) Ly tâm 13000 v/p trong 10 phút sau đó thu tủa.
(8) Bổ sung 700μl cồn 70% để rửa, lắc nhẹ sau đó ly tâm 13000v/p trong 10 phút.
(9) Thu cặn sau đó làm khô trong thời gian 30 phút. (10) Bổ sung 40μl H2O khử RNAse, ủ ở 37o
C trong 30 – 60 phút.
(11) Tiến hành điện di kiểm tra sản phẩm tách plasmid trên gel agarose 0,8%.