3. Nội dung nghiên cứu
3.2.2.Tạo vector chuyển gen mang cấu trúc RNAi [CPi(SMV-BYMV)]
bằng kỹ thuật Gateway
Plasmid pEN-CPi(SMV-BYMV) tiếp tục tham gia phản ứng LR với pK7GWIWG2(II) để tạo vector chuyển gen nhị thể mang vùng gen CPi (pGW-CPi(SMV-BYMV) và dòng hóa vào tế bào khả biến E. coli DH5α. Để chọn đƣợc dòng khuẩn lạc mong muốn, phản ứng colony-PCR đã đƣợc thực hiện kiểm tra sự có mặt của vùng gen CPi trong tế bào E.coli.
Vector nhị thể là vector có hai vector (plasmid) cùng có mặt và hoạt động trong Agrobacterium. Một plasmid tách dòng từ E.coli trong đó có thiết
1 2 M 3kb 2kb 1 2 M
kế vùng bờ trái và bờ phải, nằm giữa chúng là các gen chỉ thị và vùng gắn gen cần chuyển. Plasmid thứ hai là Ti-plasmid cải tiến: toàn bộ vùng T-DNA và vùng bờ trái và bờ phải bị cắt bỏ chỉ giữ lại vùng vir, plasmid này đƣợc gọi là plasmid hỗ trợ. Hệ thống vector này cũng hoạt động theo cơ chế chuyển gen của vi khuẩn đất Agrobacterium một cách rất hữu hiệu.
Phản ứng LR là phản ứng xảy ra sự tái tổ hợp giữa các vị trí attL và attR đƣợc xúc tác bởi enzyme LR ClonaseTMII đƣợc thực hiện giữa vector pEN-CPi với vector nhận destination pK7GWIWG2(II) Kết quả sẽ tạo đƣợc vector biểu hiện thực vật mang cấu trúc RNAi với hai vị trí chèn đoạn gen đƣa vào theo chiều sene và antiense đƣợc ngăn cách bởi một đoạn intron dƣới sự điều khiển của promoter CaMV35S (kí hiệu: pGW –CPi(SMV-BYMV).
Vector pK7GWIWG2(II) là vector chuyển gen có cấu trúc đặc biệt, có hai vùng chứa cấu trúc attR1- ccdB- attR2 ngƣợc chiều nhau đƣợc nối với nhau bởi một đoạn intron. Vì vậy, sản phẩm của phản ứng LR là một plasmid pGW-CPi(SMV-BYMV) với hai vị trí tái tổ hợp mang đoạn gen có chiều sense – intron - antisense (hay gene – intron - antigene). Quá trình thực hiện phản ứng LR để trao đổi đoạn gen quan tâm với đoạn ccdB đƣợc tiến hành với các bƣớc đã trình bày ở mục (2.2.4).
Cấu trúc pGWSMV-BYMV-CPi đƣợc dòng hóa trong tế bào E. coli One Shop®Top 10 bằng phƣơng pháp sốc nhiệt. Các bƣớc đƣợc trình bày ở mục (2.2.4) để kiểm tra phản ứng LR có thành công không. Kết quả thu đƣợc một lƣợng lớn khuẩn lạc trắng trên môi trƣờng chọn lọc.
Do vector pK7GWIWG2(II) có mang gen kháng các kháng sinh chọn lọc (streptomycin, spectinomycin, chloramphenicol) và gen ccdB – gen mã hóa plasmid F gây chết tế bào E.coli còn vector cấu trúc RNAi pGW-
Hình 3.6: Sơ đồ mô tả phản ứng LB tạo vector pK7GW –CPi(SMV- BYMV)
Mặt khác, chủng E. coli Top 10 không kháng bất kì kháng sinh nào, vì vậy những khuẩn lạc mọc trên đĩa thạch là những khuẩn lạc dƣơng tính có mang plasmid pK7GWIWG2(II) mà vị trí chứa đoạn gen ccdB đã bị đột biến hoặc mang pGW-CPi(SMV-BYMV). Vì vậy, để chọn đƣợc dòng khuẩn lạc mong muốn, chúng tôi tiến hành phản ứng colony - PCR. Chọn lọc các khuẩn lạc dƣơng tính trên môi trƣờng LB bổ sung các kháng sinh streptomycin 40 mg/l, Spectinomycin 100 mg/l và Chloramphenicol 50 mg/l.