3. Nội dung nghiên cứu
2.1. Vật liệu nghiên cứu
2.1.1. Vật liệu
Đoạn gen CPi nhân tạo của SMV và BYMV có ký hiệu CPi (SMV, BYMV) với kích thƣớc 573 nucleotide đƣợc thiết kế bao gồm đoạn bảo thủ của gen CP ở SMV và BYMV dựa trên phân tích đoạn gen CP của SMV và BYMV đã phân lập và các trình tự đƣợc công bố trên GenBank.
Các vector: Vector tách dòng pBT, Vector chuyển gen K7GWIWG2(II) (Karimi et al., 2002), vector tách dòng pENTRTM/D-TOPO®.
A B C
Hình 2.1: Sơ đồ cấu trúc vector sử dụng trong nghiên cứu
A. Vector tách dòng pBT; B. Vector tách dòng pENTRTM/D-OPO®; C. Vector chuyển gen pK7GWIWG2(II);
Chủng vi khuẩn E.coli One Shot® TOP 10 (Invitrogen), E.coli DH5α và chủng A. tumefaciens CV58C1 mang plasmid gây độc pGV2660.
2.1.2. Hoá chất
Các loại hóa chất thông dụng: Thang DNA 1 kb (Fermentas), kit tinh sạch DNA (QIAgen), TA cloning kit (Invitrogen), nƣớc khử ion, ampicillin, X-gal, agarose của hãng Merck, Sigma, Amersham Pharmacia Biotech, kanamycin.
Môi trƣờng LB lỏng (1% tripton, 0,5% dung dịch chiết nấm men, 1% NaCl), vectơ tách dòng pBT, do Phòng Công nghệ tế bào thực vật cung cấp. Dung dịch điện di DNA: dung dịch đệm TAE 50X (Tris base, acid acetic, EDTA), agarose 1%, ethidium bromide (EtBr), đệm kiểm tra mẫu DNA 5X (Tris-HCl, EDTA, glycerol, bromphenol blue).
2.1.3. Máy móc, thiết bị
Máy PCR system 9700 (Applied Biosystem, Mỹ), máy điện di Powerpac 300 (Bio-Rad, Mỹ), máy lắc, bể ổn nhiệt, máy chụp ảnh (Amersham Pharmacia Biotech, Thụy Điển), máy Vortex (Minishaker, IKA, Đức), máy ly tâm lạnh, Tủ lạnh sâu – 800C và – 200C Sanyo – Nhật Bản, cùng các trang thiết bị khác của phòng DNA ứng dụng và Phòng thí nghiệm trọng điểm công nghệ gen, Viện Công nghệ sinh học.
2.1.4. Địa điểm nghiên cứu
Các thí nghiệm của đề tài luận văn đƣợc thực hiện tại Phòng Công nghệ ADN& Ứng dụng, Viện Công nghệ sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
Các thí nghiệm thiết kế vector đƣợc tiến hành theo mô hình của Karimi và cộng sự ( 2002) thể hiện ở Hình 2.2.
Hình 2.2. Sơ đồ mô tả các bƣớc thiết kế vector mang cấu trúc RNAi bằng kỹ thuật Gateway(Karimi et al., 2002)
2.2.1. PCR khuếch đại vùng CPi (SMV, BYMV)
Phản ứng PCR khuếch đại vùng gen CPi (SMV- BYMV) đƣợc thiết kế với cặp mồi SMV-CPi-F/BYMV-CPi-R có trình tự :
SMV-CPi-F: 5’- caccgcagcagaagcttaca -3’ BYMV-CPi-R: 5’- atgttccgaaccccaagcaa -3’
Phản ứng đƣợc tiến hành với thành phần phản ứng PCR đƣợc trình bày ở Bảng 2.1.
Bảng 2.1. Thành phần phản ứng PCR
STT Thành phần Thể tích(μl)
1 Nƣớc cất khử ion 17
2 PfuBuffer PCR(10X) và MgSO4 2.5
3 dNTPs (10mM) 2.5
4 Mồi xuôi (10 pmol/μl) 1 5 Mồi ngƣợc (10 pmol/μl) 1
6 Mẫu DNA 0.5
7 Pfu– polymerase 0.5
8 Tổng thể tích 25
Chu trình nhiệt của phản ứng PCR:
Biến tính ở 95oC trong 3 phút, lặp lại 30 chu kỳ nhiệt (95oC/30giây, 540C/ 30 giây, 72 oC /1 phút 30 giây), hoàn thiện và kéo dài chuỗi ở 72 oC /7 phút và kết thúc phản ứng ở 4 o
C .
2.2.2. Phƣơng pháp tách dòng gen
a. Tinh sạch và gắn đoạn gen vào vector tách dòng pBT
- Tinh sạch sản phẩm PCR:
(1) Điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 1% và cắt lấy băng quan tâm. (2) Bổ sung dung dich đệm GB theo tỉ lệ: Vmẫu : VGB = 1 : 1 ( 1 μl tƣơng
ứng với 1 mg mẫu).
(3) Ủ ở 600C 10 phút trộn nhẹ một lần, sau khi gel tan hết ủ thêm 5 phút cho gel tan hoàn toàn.
(4) Chuyển hỗn hợp dung dịch lên cột thôi gel Qiaquick spin column, ly tâm 13000 v/p trong 1 phút. Loại bỏ dịch chảy qua cột.
(5) Bổ sung thêm 700μl WB, ly tâm 13000 v/p trong 1 phút. Loại bỏ dịch chảy qua cột.
(6) Thêm 500μl đệm rửa WB vào cột, để rửa sạch sản phẩm.Để ở nhiệt độ phòng trong 5 phút.Ly tâm 13000 v/p trong 1 phút, loại bỏ dịch chảy qua cột, ly tâm bổ sung 1 phút để loại hết dung dịch WB.
(7) Chuyển cột sang ống Eppendorf 1,5 ml . Hòa tan DNA trong 30 – 50μl H20 khử ion, để ở nhiệt độ phòng 1 phút sau đó ly tâm 13000 v/p trong 1 phút, lấy dịch.
(8) Điện di kiểm tra sản phẩm.
- Gắn đoạn gen vào vector tách dòng pBT:
Sản phẩm PCR sau khi tinh sạch đƣợc gắn vào vector tách dòng pBT để tạo plasmid tái tổ hợp mang đoạn gen quan tâm.
Hỗn hợp phản ứng đƣợc ủ 5 phút ở nhiệt độ phòng (22 – 23oC). Sau đó đặt ống dung dịch phản ứng trên đá và thực hiện quá trình biến nạp vào tế bào khả biến E. coli chủng DH5α.
Bảng 2.2. Thành phần phản ứng ghép nối gen với vector pBT STT Thành phần Thể tích (μl) 1 Sản phẩm PCR tinh sạch 5 2 Đệm T4 ligase (10X) 2 3 T4 ligase (1U/μl) 1 4 Vector pBT (30 ng/μl) 1 5 H20 khử ion 1 Tổng Tổng thể tích 10
b. Biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến E.coli DH5α - Tạo tế bào khả biến:
(1) Tế bào E.coli DH5α đƣợc cấy ra môi trƣờng LB đặc và nuôi qua đêm ở 370C.
(2) Chọn một khuẩn lạc nuôi cấy trong 5 ml LB lỏng, lắc 200 v/p, ở 370C, qua đêm.
(3) Hút 1% dịch khuẩn ở trên cho vào 50ml LB, lắc 200 v/p, ở 370C trong 2-3 giờ. Đo OD600nm đạt 0,4 - 0,6 thì chuyển dịch sang cấy ống ly tâm, để 15 phút trong đá (hoặc ở 40
C).
(4) Ly tâm 4000 v/p, ở 40C, trong 5 phút (lặp lại 3 lần, để trong đá lần thứ hai 30 phút, lần thứ ba 60 phút). Đổ dịch CaCl2, hòa tan trong 1ml
CaCl2/100ml LB ban đầu, sau đó bổ sung 15 – 20% glycerol.
(5) Chia 50μl dịch tế bào khả biến vào mỗi ống Eppendorf 2,5ml. Bảo quản tế bào khả biến trong tủ lạnh – 840
C.
- Biến nạp:
(1) Bổ sung 5μl vectơ đã gắn gen vào ống đựng tế bào khả biến đã làm tan đá và trộn nhẹ bằng tay. Hỗn hợp đƣợc ủ trong đá 30 phút.
(2) Sốc nhiệt tế bào ở 42oC trong 45 giây và chuyển ngay vào đá, để trên đá 5 phút.
(3) Bổ sung 250μl môi trƣờng LB lỏng ở nhiệt độ phòng. Hỗn hợp đƣợc nuôi lắc 200 v/p trong vòng 1 giờ ở 370
C.
(4) Sử dụng que cấy trải đã khử trùng trải 200 μl dịch khuẩn biến nạp lên đĩa LB chọn lọc chứa ampicilin 100mg/l, X- gal 30mg/l và 200 mM IPTG. (5) Nuôi ở 37oC qua đêm trong vòng 16 giờ.
c. Chọn dòng khuẩn lạc bằng colony – PCR.
Sau khi nuôi đĩa khuẩn đã biến nạp trên môi trƣờng chọn lọc, thấy xuất hiện nhiều khuẩn lạc trắng. Chọn ra một số khuẩn lạc trắng để chạy phản ứng colony – PCR với cặp mồi pUC18-F/pUC18-R nằm trên vector pBT để xác định khuẩn lạc có mang đoạn gen đã đƣa vào. Thành phần và chu kỳ nhiệt cũng giống nhƣ phản ứng PCR nhân gen mục (2.2.1),mẫu DNA đƣợc thay bằng khuẩn lạc. Sản phẩm đƣợc điện di kiểm tra trên gel agarose 0.8% để chọn ra những khuẩn lạc mang gen có kích thƣớc nhƣ mong muốn.
d. Tách chiết plasmid tái tổ hợp
Chuẩn bị hóa chất:
- Sol II: 0,2 NaOH; SDS 1%
- Sol III: 60 ml CH3COOK 5M; 11,5 ml CH3COOH; 28,5 ml H20 Các bƣớc tiến hành:
(1) Lấy 2ml dịch khuẩn nuôi cho vào ống Eppendorf 2ml, ly tâm 8000 v/p trong 5 phút để thu cặn tế bào.
(2) Loại dịch nổi, thu cặn, sau đó bổ sung 200μl sol I(lạnh), vortex cho tan đề. (3) Bổ sung 400μl sol II, đảo nhẹ bằng cách đảo ngƣợc ống Eppendorf
khoảng 10 lần(phá vỡ màng tế bào vi khuẩn).
(4) Bổ sung 300μl sol III(lạnh), đảo nhẹ bằng cách đảo ngƣợc ống Eppendorf,sau đó ly tâm 13000 v/p trong 10 phút.
(5) Thu dịch nổi sau đó bổ sung hỗn hợp chloroform: isoamyl (24 : 1), đảo nhẹ. Ly tâm 13000 v/p trong 10 phút.
(6) Thu phần dịch nổi, hút 600μl mẫu sau đó bổ sung isopropanol lạnh theo tỉ lệ 1 : 1, sau đó để trong tủ đá.
(7) Ly tâm 13000 v/p trong 10 phút sau đó thu tủa.
(8) Bổ sung 700μl cồn 70% để rửa, lắc nhẹ sau đó ly tâm 13000v/p trong 10 phút.
(9) Thu cặn sau đó làm khô trong thời gian 30 phút. (10) Bổ sung 40μl H2O khử RNAse, ủ ở 37o
C trong 30 – 60 phút.
(11) Tiến hành điện di kiểm tra sản phẩm tách plasmid trên gel agarose 0,8%.
2.2.3. Phản ứng lai ghép gen CPi với vector pENTRTM
/D-TOPO®
Đoạn gen CPi tiếp tục đƣợc dòng hóa vào vector pENTRY/D để tạo ra dòng entry pENTR/D mang CPi (kí hiệu pEN-CPi) có chứa các vị trí tái tổ hợp attL. Đây là vị trí sẽ tái tổ hợp với attR trên pK7WIWG2(II) khi có sự
xúc tác của enzyme đặc hiệu.
Bảng 2.3: Thành phần phản ứng ghép nối gen với vector pENTRTM/D- TOPO® STT Thành phần Thể tích(μl) 1 Sản phẩm PCR tinh sạch 0,5 - 4 2 Salt solution 1 3 Vector pENTR 1 4 H20 khử ion 0 – 3,5 Tổng Tổng thế tích 6 Hỗn hợp phản ứng đƣợc ủ 5 phút ở nhiệt độ phòng (22 – 23oC). Sau đó đặt ống dung dịch phản ứng trên đá và thực hiện quá trình biến nạp vào tế bào khả biến E. coli One Shot® Top 10.
Biến nạp plasmid tái tổ hợp pEN – gen vào tế bào khả biến E. coli One Shot®
Top 10.
(1) Bổ sung 2μl vectơ đã gắn gen vào ống đựng tế bào khả biến đã làm tan đá và trộn nhẹ bằng tay. Hỗn hợp đƣợc ủ trong đá 15 phút.
(2) Sốc nhiệt tế bào ở 42oC trong 30 giây và chuyển ngay vào đá, để trên đá 10 phút.
(3) Bổ sung 250μl môi trƣờng S.O.C ở nhiệt độ phòng. Hỗn hợp đƣợc nuôi lắc 200 v/p trong vòng 1 giờ ở 370C.
(4) Sử dụng que cấy trải đã khử trùng trải 50 – 200 μl dịch khuẩn biến nạp lên đĩa chọn lọc chứa kanamycin 50mg/l đƣợc làm ấm lại.
(5) Ủ đĩa petri ở 37oC qua đêm trong vòng 16 giờ.
Chọn dòng khuẩn lạc bằng colony – PCR
Sau khi nuôi đĩa khuẩn đã biến nạp trên môi trƣờng chọn lọc, thấy xuất hiện nhiều khuẩn lạc trắng. Chọn ra một số khuẩn lạc trắng để chạy phản ứng colony – PCR với cặp mồi M13-F và M13-R nằm trên vector pENTRTM/D-TOPO® để xác định khuẩn lạc có plasmid mang đoạn gen đã đƣa vào. Thành phần và chu kỳ nhiệt cũng giống nhƣ phản ứng PCR nhân gen mục (2.2.1), mẫu DNA đƣợc thay bằng khuẩn lạc. Sản phẩm đƣợc điện di kiểm tra trên gel agarose 0.8% để chọn ra những khuẩn lạc mang gen có kích thƣớc nhƣ mong muốn.
2.2.4. Phƣơng pháp tạo vector chuyển gen mang cấu trúc RNAi bằng kỹ thuật Gateway thuật Gateway
Phƣơng pháp tạo vector chuyển gen bằng kỹ thuật Gateway đƣợc thực hiện bằng phản ứng LR giữa vector chuyển gen pK7GWIWG2(II) với plasmid mang đoạn gen CPi quan tâm.
Phản ứng LR
Bảng 2.4. Thành phần phản ứng LR STT Thành phần Thể tích (μl) 1 Plasmid pEN-gene (50 – 150 ng) 1 2 Vector pK7GWIWG2(II) (150 ng/ μl) 0.5 3 Nƣớc khử ion, khử trùng 2.5 Tổng 4 Các bƣớc tiến hành:
(1) Bổ sung các thành phần trên vao ống ly tâm 1.5 ml ở nhiệt độ phòng và trộn nhẹ.
(2) Làm tan hỗn hợp enzyme LR ClonaseTM trên đá khoảng 2 phút. Trộn nhẹ 2 lần, mỗi lần khoảng 2 giây.
(3) Bổ sung vào ống ly tâm 2 μl enzyme LR ClonaseTM (4) Ủ phản ứng ở 25oC trong 1 giờ.
(5) Bổ sung 1 μl dung dịch proteinase K để kết thúc phản ứng và ủ ở 37oC trong 10 phút.
Biến nạp
(1) Chuyển 3 μl phản ứng LR vào 50 μl tế bào E.coli One Shot ® TOP 10. (2) Ủ trong đá 30 phút. Sốc nhiệt tế bào ở 42oC trong 45 giây.
(4) Chuyển 50 – 250 μl vào các đĩa chọn lọc chứa kháng sinh streptomycin 40 mg/l, spectinomycin 100 mg/l và chloramphenicol 100 mg/l. Sau đó tách chiết plasmid.
2.2.5. Tạo tế bào khả biến A. tumefaciens mang vector chuyển gen
Cấu trúc pGW-CPi (SMV-BYMV) đƣợc biến nạp vào tế bào A. tumefaciens chủng CV58C1 pGV2260 bằng phƣơng pháp xung điện. Trƣớc
khi biến nạp vector tái tổ hợp pGW-CPi (SMV-BYMV) vào tế bào A. tumefaciens CV58C1 mang plasmid gây độc pGV2260 bằng phƣơng pháp xung điện, tế bào này đƣợc làm cho khả biến theo Sambrook và cộng sự (1998). Quy trình thí nghiệm nhƣ sau:
(1) Làm mới giống trên môi trƣờng LB đặc, sau đó nuôi lắc 1 khuẩn lạc trong 2ml môi trƣờng LB lỏng ở 280C trong 6 giờ.
(2) Lấy 100 μl dung dịch vi khuẩn nuôi cấy tiếp ở 280C qua đêm trong 100 ml LB lỏng có bổ sung kháng sinh chọn lọc đến khi OD600nm = 1-1.5.
(3) Làm lạnh mẫu trong đá trong 15 phút, ly tâm 5000 vòng/ phút trong 20 phút để thu cặn tế bào. Rủa cặn hai lần trong 10 ml 1mM HEPES (N-2- hydroxyethylpiperazine-N’-2- ethanessulfonic acid) pH 7.0.
(4) Cặn tế bào hòa tan trong 500 – 700 μl 10% glycerol.Chia 45 μl dịch tế bào vào mỗi ống Eppendorf, làm lạnh trong nitơ lỏng và giữ chủng ở -850
C. Khi đã có đƣợc tế bào khả biến A. tumefaciens, tiến hành biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào bằng phƣơng pháp xung điện.
Biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào bằng phương pháp xung điện
(1) Tế bào khả biến đƣợc đặt trong đá 5 phút, sau đó bổ sung 1 μl vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến và trộn nhẹ.
(2) Rửa cuvet bằng cồn 1000 và tráng lại bằng nƣớc khử ion, thấm khô và khử trùng bằng tia UV.chuyển tất cả hỗn hợp vector tái tổ hợp và tế bào khả biến A. tumefaciens vào cuvet.
(3) Xung điện ở 2.5 kv, 25 μF và điện trở 400 sau đó dặt ngay vào trong đá, sau 5 phút bổ sung 1 ml YEB (hoặc LB lỏng).
(4) Chuyển 300 μl vào các đĩa chọn lọc chứa kháng sinh streptomycine 40 mg/l, spectinomycine 100 mg/l và rifamycin 50 mg/l, ủ ở 280C từ 24 – 48 giờ. Tiến hành colony – PCR chọn lọc các dòng khuẩn thu đƣợc. Cuối cùng điện di và kiểm tra sản phẩm.
Chƣơng 3
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1. KẾT QUẢ KHUẾCH ĐẠI VÙNG GEN CPi CỦA SMV VÀ BYMV
Tiến hành khuếch đại vùng CPi của SMV và BYMV từ đoạn gen nhân tạo bằng PCR với cặp mồi SMV-CPi-F/BYMV-CPi-R và sản phẩm đƣợc điện di trên gel agarose 0,8%, kết quả thu đƣợc đoạn CPi có kích thƣớc nhƣ thiết kế là 0,573kb (Hình 3.1).
Hình 3.1: Hình ảnh điện di sản phẩm PCR vùng CPi của SMV và BYMV
(M: thang DNA 1kb; CPi: vùng bảo thủ CPi khuếch đại từ đoạn CP nhân tạo)
Vùng CPi(SMV-BYMV) đƣợc thiết kế bao gồm trình tự thuộc vùng bảo thủ gen CP của cả hai loài virus SMV và BYMV.
Đoạn CPi nhận đƣợc từ phản ứng PCR đƣợc tinh sạch nhằm loại bỏ các thành phần tạp chất trong sản phẩm PCR nhƣ mồi, đệm, dNTPs…Bởi các
0,573kb 0,5kb
1,0kb
muối có trong đệm PCR sẽ làm ảnh hƣởng đến nồng độ đệm thích hợp cho enzyme thực hiện phản ứng lai ghép.
3.2. KẾT QUẢ THIẾT KẾ VECTOR MANG CẤU TRÚC RNAi CHỨA VÙNG GEN CPi CỦA SMV VÀ BYMV
3.2.1. Tạo vector tái tổ hợp pENTRTM/D-TOPO®
Sản phẩm PCR CPi đƣợc làm sạch bằng Kit GeneJET PCR Purification của hãng Thermo Scientific và đƣợc gắn vào vector pENTR theo bộ Kit pENTR™/D-TOPO® tạo plasmid tái tổ hợp có mang vùng CPi [(CPi (pEN- SMV-BYMV)]. Dựa vào sự hình thành mối liên kết hydro giữa 4 nucleotide CACC đầu 5’của sản phẩm PCR, với 4 nucleotide GTGG đầu 3’trên vector và nhờ enzyme topoisomerase (TOPO) ở trên vector nối các đầu của sản phẩm PCR vào vector mà plasmid tái tổ hợp pENTR/D có gắn các đoạn gen quan tâm đƣợc tạo thành (Thành phần phản ứng đƣợc trình bày ở Bảng 2.4).
Vector pENTRTM/D-TOPO®là vector đầu vào cho phản ứng lai LR trong kỹ thuật Gateway có kích thƣớc 2850bp, trên vector có hai vị trí attL1 và attL2, đoạn gen cần chuyển sẽ đƣợc gắn vào giữa hai vị trí này (Hình 3.3).
Sản phẩm gắn pENTR/D đƣợc biến nạp vào tế bào khả biến E.coli
One Shop® Top 10 bằng phƣơng pháp sốc nhiệt để dòng hóa và nhân nhanh plasmid với số lƣợng lớn. Kết quả thể hiện ở sản phẩm biến nạp thành công plasmid tái tổ hợp có mang vùng gen CPi [pENCPi (SMV- BYMV)] vào vi khuẩn E. coli One Shop® Top 10 thu đƣợc một lƣợng lớn
Hình 3.3. Sơ đồ mô tả phản ứng lai ghép đoạn gen CPi với vector pENTRTM/D-TOPO® tạo vector tái tổ hợppEN-CPi (SMV-BYMV)
Để kiểm tra sự có mặt của các đoạn gen trong các dòng khuẩn lạc chúng tôi tiến hành kiểm tra bằng phản ứng colony – PCR với cặp mồi M13-F/M13-R bổ sung với trình tự nằm trên vector, cặp mồi M13 có trình