3. Nội dung nghiên cứu
1.3.3.Ứng dụng kỹ thuật RNAi trong nghiên cứu tạo cây chuyển gen
kháng virus
RNAi là một hiện tƣợng phổ biến xảy ra ở sinh vật nhân chuẩn và đóng vai trò quan trọng trong nhiều quá trình sinh học nhƣ điều hoà sự phát triển, tổ chức lại nhiễm sắc thể và đặc biệt là quá trình kháng virus [16]. Gần đây, RNAi đƣợc xem là một kỹ thuật hiện đại và hữu hiệu chống lại các bệnh do virus gây ra ở thực vật. Năm 2004, Baulcombe đã công bố cơ chế hoạt động của siRNA và coi đó là một cơ chế quan trọng trong việc kháng lại virus ở thực vật. Hơn nữa, kỹ thuật RNAi có thể giúp cho việc nghiên cứu chức năng của gen trong genom thực vật. Điều này đã mở ra triển vọng sử dụng các thƣ viện siRNA để nhận biết và phân tích sự biểu hiện của hàng loạt các gen liên quan đến các bệnh của thực vật. Thƣ viện các nhân tố RNAi có thể đƣợc xem nhƣ là một công cụ hữu hiệu để phân tích chức năng hệ gen cây trồng. Xây dựng thƣ viện RNAi của tất cả các bệnh virus trên một đối tƣợng cây trồng cụ thể sẽ góp phần phục vụ cho việc sàng lọc các biểu hiện bệnh virus [28].
Tính hiệu quả của kỹ thuật RNAi trong việc tạo cây trồng chuyển gen mã hoá protein của virus (CP, Rep...) có khả năng kháng lại chính virus đó đã đƣợc chứng minh bằng thực tế. Nhiều giống cây trồng kháng virus đã tạo ra bằng kỹ thuật này đó là kháng PVY (Waterhouse et al., 1998; Smith et al., 2000; Missiou et al., 2004), BYDV-PAV (barley yellow dwarf virus-PAV) (Wang et al., 2000), CMV (Kalantidis et al., 2002), PPV, (plum pox potyvirus) (Nicola-Negri et al., 2005), TMV (Kai et al., 2005), CGMMV
(Cucumber green mottle mosaic virus) (Park et al., 2005)… Trong những nghiên cứu này, cấu trúc RNAi có chứa trình tự gen của virus lặp lại đảo chiều thƣờng đƣợc sử dụng để chuyển vào cây và sẽ đƣợc biểu hiện thành RNA sợi đôi dạng kẹp tóc (hairpin RNA, hpRNA) trong cây chuyển gen từ đó kích thích cơ chế RNAi hoạt động khi có sự xâm nhập của virus vào cây. Ngƣời ta đã nhận thấy rằng khi vùng đệm của hpRNA đƣợc lặp lại với một trình tự intron (ihpRNA) thì kết quả ihpRNA tạo ra sự câm gen là cao nhất [25]. Năm 2007, Bonfim và cộng sự đã tạo ra đƣợc một dòng cây đậu chuyển gen kháng virus BGMV (Bean golden mosaic virus) với tính kháng lên đến 93%. Lim và đtg (2007) nghiên cứu chuyển gen HC-pro vào cây đậu tƣơng đã nhận thấy rằng, cây chuyển gen khi bị lây nhiễm SMV sau 2 tuần triệu chứng nhiễm bệnh khảm lá do SMV biến mất và lƣợng SMV đã giảm đáng kể, tuy nhiên HC-Pro của SMV đã gây biến đổi hình thái lá và giảm sự tạo hạt ở các cây đậu tƣơng chuyển gen. Cũng năm này, Shinichiro Kamachi và đtg đã công bố kết quả tạo ra đƣợc một số dòng thuốc lá chuyển gen CP trong cấu trúc ihpRNA có khả năng kháng cao virus CGMMV đến thế hệ T2 (12/14 số cây kiểm tra) và những siRNA đã đƣợc phát hiện trong những dòng cây chuyển gen này. Nói chung, hầu hết các cây chuyển gen làm chậm sự tích lũy virus và làm chậm hoặc giảm nhẹ các triệu chứng bệnh.
Chƣơng 2
VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU