3. Nội dung nghiên cứu
2.2.5.Tạo tế bào khả biến A.tumefaciens mang vector chuyển gen
Cấu trúc pGW-CPi (SMV-BYMV) đƣợc biến nạp vào tế bào A. tumefaciens chủng CV58C1 pGV2260 bằng phƣơng pháp xung điện. Trƣớc
khi biến nạp vector tái tổ hợp pGW-CPi (SMV-BYMV) vào tế bào A. tumefaciens CV58C1 mang plasmid gây độc pGV2260 bằng phƣơng pháp xung điện, tế bào này đƣợc làm cho khả biến theo Sambrook và cộng sự (1998). Quy trình thí nghiệm nhƣ sau:
(1) Làm mới giống trên môi trƣờng LB đặc, sau đó nuôi lắc 1 khuẩn lạc trong 2ml môi trƣờng LB lỏng ở 280C trong 6 giờ.
(2) Lấy 100 μl dung dịch vi khuẩn nuôi cấy tiếp ở 280C qua đêm trong 100 ml LB lỏng có bổ sung kháng sinh chọn lọc đến khi OD600nm = 1-1.5.
(3) Làm lạnh mẫu trong đá trong 15 phút, ly tâm 5000 vòng/ phút trong 20 phút để thu cặn tế bào. Rủa cặn hai lần trong 10 ml 1mM HEPES (N-2- hydroxyethylpiperazine-N’-2- ethanessulfonic acid) pH 7.0.
(4) Cặn tế bào hòa tan trong 500 – 700 μl 10% glycerol.Chia 45 μl dịch tế bào vào mỗi ống Eppendorf, làm lạnh trong nitơ lỏng và giữ chủng ở -850
C. Khi đã có đƣợc tế bào khả biến A. tumefaciens, tiến hành biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào bằng phƣơng pháp xung điện.
Biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào bằng phương pháp xung điện
(1) Tế bào khả biến đƣợc đặt trong đá 5 phút, sau đó bổ sung 1 μl vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến và trộn nhẹ.
(2) Rửa cuvet bằng cồn 1000 và tráng lại bằng nƣớc khử ion, thấm khô và khử trùng bằng tia UV.chuyển tất cả hỗn hợp vector tái tổ hợp và tế bào khả biến A. tumefaciens vào cuvet.
(3) Xung điện ở 2.5 kv, 25 μF và điện trở 400 sau đó dặt ngay vào trong đá, sau 5 phút bổ sung 1 ml YEB (hoặc LB lỏng).
(4) Chuyển 300 μl vào các đĩa chọn lọc chứa kháng sinh streptomycine 40 mg/l, spectinomycine 100 mg/l và rifamycin 50 mg/l, ủ ở 280C từ 24 – 48 giờ. Tiến hành colony – PCR chọn lọc các dòng khuẩn thu đƣợc. Cuối cùng điện di và kiểm tra sản phẩm.
Chƣơng 3
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU