L ỜI CẢM ƠN
2.5.2.Thời gian
Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1. Xác định hàm lượng nước của nguyên liệu
10 g rau tươi được chưng cất với 100 ml Xylen trong 3 giờ. Kết quả của 3 lần lặp lại đượcthể hiện ởbảng 3.1
Bảng 3.1 Hàm lượng nướccủa nguyên liệu
Lần 1 Lần 2 Lần3 Trung bình Hàm lượng nước của nguyên liệu (%) 80,0 82,0 80,3 80,8 Nhận xét
Như vậy, hàm lượng nước của nguyên liệu lá tía tô là 80,8 %. Kết quả phân tích cho thấy nguyên liệu chứa một lượng nước khá lớn một phần là do đặc tínhcủa nguyên liệu, một mặt do quá trình thu hoạch và vận chuyển. Độ ẩm nguyên liệu cũng là một yếu tố ảnh hưởng đến lượng nguyên liệu sử dụng khi chưng cất tinh dầu, độ ẩm càng cao, lượng nguyên liệu tiêu tốn để sản xuất tinh dầu càng lớn.
3.2. Hàm lượng tinh dầu có trong nguyên liệu khảo sát
300 g mẫu rau tươi được phơi héo một ngày ở nhiệt độ phòng, chưng cất trong 4 giờ. Kết quả lượng tinh dầu thu được của 3 lần lặp lại đ ược thể hiện ở bảng3.2
Bảng 3.2 Hàmlượng tinh dầu thu được
Lần 1 Lần 2 Lần 3 Trung bình
Hàm lượng
tinh dầu thu được theo chất
Nhận xét
Lượng tinh dầu tía tô trung bình thu được của 300 g mẫu rau t ươi để héo một
ngày là 0,280 g. Hàm lượng tinh dầu có trong nguyên liệu tính được là: 0,093 %
theo chất tươi. Vậy muốn thu được 1 lít tinh dầu tía tô (chưa tính đến tỉ trọng), chúng ta cần đến 1071 kg lá rau tươi. Hàm lượng tinh dầu trong nguyên liệu được tính theo chất khô sẽ là: 0,487 %. Hàm lượng tinh dầu trong nguyên liệu thấp, do vậy nếu đi vào sản xuất sẽ dẫn đến việc tiêu tốn một lượng nguyên liệu khá lớn, điều này sẽ là yếu tố quyết định đến giá cả của tinh dầu.
Theo nghiên cứu củaPGS-TS Lê Ngọc Thạch- Chủ nhiệm Bộ môn Hóa học
Hữu cơ, Trường Đại Học Khoa Học Tự Nhi ên, Đại Học Quốc Gia Tp Hồ Chí Minh khi khảo sát tinh dầu tía tô trên cây 4 tháng tuổi được trồng tại Hóc Môn, Tp. Hồ Chí Minh, được thu hái vào lúc 8 giờ sáng và được chưng cất ngay sau khi thu hái, hàm lượng tinh dầu đạt được cao nhất là 0,22 % theo chất tươi. Điều đó chứng tỏ hàm lượng tinh dầu phụ thuộc rất nhiều vào nguồn gốc nguyên liệu, độ tuổi của cây và thời gian làm héo. Vì vậy, khi sản xuất tinh dầu trên quy mô công nghiệp vấn đề trên sẽ là những yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất trích ly tinh dầu, nếu không thể sản xuất ngay tinh dầu trên nguyên liệu tươi thì cũng cần có biện pháp làm héo và bảo quản nguyên liệu thích hợp để giảm đi sự thất thoáttinh dầu.
3.3. Kết quả định tính sơ bộ hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu
tía tô
3.3.1. Điều kiện thử nghiệm
Phương pháp sử dụng: phương pháp khuếch tán qua đĩa giấy.
Môi trường: MHA.
Vi khuẩn thử nghiệm: Bacillus cereus
E.coli ATCC 25922 Klebsiella MRSA Proteus P.aeruginosa ATCC 27853 Salmonella typhi Shigella
Staphylococcus aureus ATCC 29213
Streptococcus feacium ATCC 29212
Nhiệt độ và thời gian ủ: 370C trong 16-18 giờ, với MRSA và S.aureusủ trong 24 giờ.
3.3.2. Kết quả
Đường kính vòng vô khuẩn đo được chính bằng đường kính đĩa giấy tẩm tinh dầu cộng với vòng tròn xung quanh đĩa giấy mà vi khuẩn không mọc được.
Kết quả chỉ có ý nghĩa khi đĩa chứng DMSO 2 % và Tween 80 0,2 % không làmảnh hưởng đến sự sinh trưởng của vi sinh vật
Kết quả định tính sơ bộ khả năng kháng khuẩn của tinh dầu tía tô nguyên chất và dung dịch tía tô 5% thể hiện ởbảng 3.3, bảng 3.4và bảng 3.5, bảng 3.6 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Bảng 3.3 Kết quả định tính s ơ bộ khả năng kháng khuẩn Gram âm của tinh dầutía tô nguyên chất
Đường kính vòng kháng khuẩn (mm)
Stt VK Gram âm
Lần1 Lần 2
1 E.coli VK không mọc trên toàn đĩa thạch VK không mọc trên toàn đĩa thạch
3 Proteus 8 8
4 P.aeruginosa - -
5 Salmonella typhi VK không mọc trên toàn đĩa thạch VK không mọc trên toàn đĩa thạch
6 Shigella VK không mọc trên toàn đĩa thạch VK không mọc trên toàn đĩa thạch
“- “: không hình thành vòng kháng xung quanh đĩa giấy.
Bảng 3.4 Kết quả định tính s ơ bộ khả năng kháng khuẩn Gram d ương của tinh dầutía tô nguyên chất
Đường kính vòng kháng khuẩn (mm)
Stt VK Gram dương
Lần 1 Lần 2
1 Bacillus cereus VK không mọc trên toàn đĩa
thạch
VK không mọc trên toàn đĩa
thạch
2 Bacillus subtilis VK không mọc trên toàn đĩa
thạch
VK không mọc trên toàn đĩa
thạch
3 MRSA VK không mọc trên toàn đĩa
thạch
VK không mọc trên toàn đĩa
thạch
4 Staphylococcus aureus
VK không mọc trên toàn đĩa
thạch
VK không mọc trên toàn đĩa (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
thạch
5 Streptococcus feacium 10 9
Nhận xét
Với thử nghiệm tinh dầu nguyên chất, kết quả cho thấy 7/11 chủng vi sinh vật khảo sát bị ức chế hoàn toàn, chúng không mọc được trên toàn mặt thạch. Điều này có thể được giải thích bởi khả năng khuếch tán khá mạnh của tinh dầu trên bề mặt thạch cùng với đặc tính dễ bay h ơi của tinh dầu ở nhiệt độ th ường, hơi của tinh dầu nguyên chất không thoát ra khỏi đĩa Petri đã làmức chế hoàn toàn sự phát triển của đa số các vi khuẩn khảo sát.
Các chủng Klebsiella, Proteus, P.aeruginosa và Streptococcus feacium mọc bình thường, tại những vị trí đặt đĩa giấy tẩm tinh dầu nguyên chất hình thành vòng
kháng khuẩn, riêng P.aeruginosa không hình thành vòng kháng. Vòng kháng khuẩn đo được tương đối nhỏ, và đồng đều nhau ở mỗi lần thử nghiệm, với Klebsiella là 9 mm, Proteus là 8 mm và Streptococcus feacium (VK Gram dương) là 9 mm (lấy giá
trị nhỏ nhất của các lần thử nghiệm).
Kết quả bước đầu cho thấy tác động của tinh dầu lên VK Gram dương mạnh hơn lên VK Gram âm. T ất cả các VK Gram d ương bị ức chế hoàn toàn bởi tinh dầu tía tô nguyên chất ngoại trừ Streptococcus feacium , tuy nhiên vòng kháng của tinh dầu đối với chủng VK này cũng lớn hơn vòng kháng đối với các chủng VK Gram âm. Điều này có thể được giải thích bởi sự khác nhau của thành tế bào của hai loại VK Gram âm và VK Gram dương.
Hình 3.1 Thành tế bào VK Gram âm và VK Gram dương
Thành tế bào Gram dương gồm một lớp Peptidoglycan dày bao bên ngoài màng sinh chất (Plasma membrane). Thành tế bào Gram âm phức tạp hơn với lớp Peptidoglycan mỏng, cách một lớp không gian chu chất ( Periplasmic space), và tới lớp màng ngoài (Outer membrane) là phức hợp lipoprotein và lipopolysaccharide. Chính cấu trúc nhiều lớp này đã bảo vệtế bào vi khuẩn Gram âm trước tác động của tinh dầu và khoảng không gian chu chất chứa độc tố và enzyme có thể làm mất tác dụng của tinh dầu trước khi tác dụng lên màng sinh chất.
Streptococcus feacium có khả năng tạo lớp vỏ nhầy bao bên ngoài thành tế bào. Lớp vỏ nhầy này đã góp phần bảo vệ vi khuẩn khỏi tác động của tinh dầu và vì vậy mà đây là VK Gram dương duy nh ất không bị ức chế hoàn toàn bởi tinh dầu tía tô nguyên chất.
Bảng 3.5 Kết quả định tính sơ bộ khả năng kháng khuẩn Gram âm của dung
dịch tinh dầutía tô 5 %
Đường kính vòng kháng khuẩn (mm) Stt VK Gram âm Lần1 Lần 2 1 E.coli 7 7 2 Klebsiella 7 7 3 Proteus 7 7 4 P.aeruginosa - - 5 Salmonella typhi - - 6 Shigella 8 8
Bảng 3.6 Kết quả định tính s ơ bộ khả năng kháng khuẩn Gram d ương của
dung dịch tinh dầutía tô 5 %
Đường kính vòng kháng khuẩn (mm) Stt VK Gram dương Lần 1 Lần 2 1 Bacillus cereus 9 9 2 Bacillus subtilis 9 10 3 MRSA - - 4 Staphylococcus aureus 7 7 5 Streptococcus feacium 7 7
Nhận xét
Tiến hành thử nghiệm với dung dịch tinh dầu 5 %, tất cả các chủng vi khuẩn nghiên cứu mọc bình thường và mọc đều trên bề mặt thạch.
Tại những chỗ đặt đĩa giấy tẩm dung dịch 5% tinh dầu tía tô, kết quả cho thấy:
Vòng kháng khuẩn của tinh dầu đối với nhữngVK Gram âm nhỏ, nằm trong khoảng 7-8 mm, riêng Salmonella typhi và P.aeruginosa không hình thành vòng kháng.
Vòng kháng khuẩn của tinh dầu đối với những VK Gram d ương lớn hơn so với vòng kháng của VK Gram âm. Đ ường kính vòng vô khuẩn đối với Bacillus subtilis trong thử nghiện lần 2 đạt đ ược 10 mm, đối với Bacillus cereus là 9 mm.
Dung dịch 5 % tinh dầu có tác dụng yếu đối với Staphylococcus aureus và Streptococcus feacium, vói đường kính vòng kháng khuẩn đo được là 7 mm, không có tác dụng với MRSA - một chủngVK được xem là hung thần của bệnh viện bởi đặc tính kháng hầu hết các loại kháng sinh của nó.
Các kết quả trên đây cho thấy một lần nữa sự tác động của tinh dầu tía tô lên VK Gram âm và VK Gram dương là khác nhau.
Tinh dầu tía tô không có tác dụng với P.aeruginosa. VK này còn được gọi là trực khuẩn mủ xanh, là VK kháng thuốc phổ biến do đó là một loài gây bệnh nguy hiểm.
Với những kết quả trên chúng tôi tiến hành xác định MIC cho tất cả các chủng vi khuẩn, có thể loại trừ P.aeruginosa vì tinh dầu nguyên chất đã không kháng được.
Dãy nồng độ tinh dầu được chọn là: 128 µg/ml, 256 µg/ml, 512 µg/ml, 1024 µg/ml, 2048 µg/ml, 4096 µg/ml, 8192 µg/ml.
3.4. Kết quả xác định MIC của tinh dầu tía tô
3.4.1. Điều kiện thử nghiệm
Phương pháp sử dụng: phương pháp pha loãng trong thạch. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Môi trường : MHA.
Vi khuẩn thử nghiệm: Bacillus cereus.
Bacillus subtilis ATCC 6633.
E.coli ATCC 25922. Klebsiella. MRSA. Proteus. Salmonella typhi. Shigella.
Staphylococcus aureus ATCC 29213.
Streptococcus feacium ATCC 29212.
Nhiệt độ và thời gian ủ: 370C trong 16-18 giờ, với MRSA và S.aureusủ trong 24 giờ.
3.4.2. Kết quả
Kết quả được thể hiện bằng giá trị MIC cần tìm, đó chính là nồng độ ức chế vi khuẩn phát triển trên mặt thạch.Kết quả chỉ có ý nghĩa khi hộp chứng môi tr ường và hộp chứng kỹ thuật vi khuẩn mọc bình thường.
Gía trị MIC của tinh dầu tía tô trên các chủng vi sinh vật nghiên cứu được thể hiện trên bảng3.7 và bảng 3.8
Bảng 3.7 Gía trị MIC của tinh dầutía tôđối với VK Gram âm
Stt VK Gram âm Nồng độ tối thiểu ức chế vi khuẩn (µg/ml)
1 E.coli 2048 2 Klebsiella 2048 3 Proteus 4096 4 P.aeruginosa Không tác dụng 5 Salmonella typhi 2048 6 Shigella 1024
Bảng 3.8 Gía trị MIC của tinh dầu tía tô đối với VK Gram d ương
Stt VK Gram dương Nồng độ tối thiểu ức chế vi khuẩn (µg/ml)
1 Bacillus cereus 1024 2 Bacillus subtilis 512 3 MRSA 2048 4 Staphylococcus aureus 2048 5 Streptococcus feacium 2048 Nhận xét:
Trong dãy nồng độ tinh dầu thử nghiệm đã xác định được MIC của tinh dầu đối với tất cả các chủng VK khảo sát, trừ P.aeruginosa. Điều này khẳng định một lần nữa tinh dầu tía tô không có tác dụng với P.aeruginosa.
Thông qua kết quả khảo sát có thể nhận thấy rằng MIC của tinh dầu tía tô đối với VK Gram âm lẫn VK Gram dương chủ yếu ở nồng độ 1024 µg/ml và 2048
khác. Riêng đối với Bacillus subtilis, một loại VK Gram dương chủ yếu chỉ gây hư hỏng thực phẩm, chỉ cần một nồng độ tinh dầu tía tô khá thấp khoảng 512 µg/ml là có thể ức chế được.
3.5. So sánh hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu tía tô với một
số tinh dầu rau thơm khác
Dựa trên kết quả nghiên cứu của Hồ Thị Ánh (2009) với đề tài: ”Bước đầu khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu húng quế v à húng cay”, và Mai Th ị Trâm Anh (2009) cũng với đề tài kháng khuẩn của tinh dầu: “Bước đầu khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu lá kinh giới” tr ường Đại Học Nông Lâm, chúng tôi đưa ra những so sánh sau:
3.5.1. Kết quả định tính
3.5.1.1. Tinh dầu nguyên chất
Kết quả định tính sơ bộ khả năng kháng khuẩn của tinh dầu tía tô nguyên chất so với yinh dầu nguyên chất củamột số loại rau thơm khác được thể hiện trên bảng 3.9 và 3.10
Bảng 3.9 Kết quả định tính s ơ bộ khả năng kháng khuẩn Gram âm của tinh
dầu nguyên chất củatía tô so vớimột số loại rau thơm
Đường kính vòng vô khuẩn(mm) Stt VK Gram âm
Tía tô Kinh giới Húng quế Húng cay
1 E.coli Vi khuẩn không (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
mọc trên toàn mặt thạch Vi khuẩn không mọc trên toàn mặt thạch Vi khuẩn không mọc trên toàn mặt thạch Vi khuẩn không mọc trên toàn mặt thạch 2 Klebsiella 9 8 8 9 3 Proteus 8 8 8 8 4 P.aeruginosa - 7 - - 5 Salmonella typhi Vi khuẩn không mọc trên toàn mặt thạch Vi khuẩn không mọc trên toàn mặt thạch Vi khuẩn không mọc trên toàn mặt thạch Vi khuẩn không mọc trên toàn mặt thạch
6 Shigella Vi khuẩn không mọc trên toàn mặt thạch Vi khuẩn không mọc trên toàn mặt thạch Vi khuẩn không mọc trên toàn mặt thạch Vi khuẩn không mọc trên toàn mặt thạch
“- “: không hình thành vòng kháng xung quanh đĩa giấy.
Bảng 3.10 Kết quả định tính s ơ bộ khả năng kháng khuẩn Gram d ương của
tinh dầu nguyên chất củatía tô so vớimột số loại rau thơm
Đường kính vòng vô khuẩn (mm)
Stt VK Gram dương
Tía tô Kinh giới Húng quế Húng cay
1 Bacillus cereus Vi khuẩn không
mọc trên toàn mặt thạch Vi khuẩn không mọc trên toàn mặt thạch Vi khuẩn không mọc trên toàn mặt thạch Vi khuẩn không mọc trên toàn mặt thạch
2 Bacillus subtilis Vi khuẩn không
mọc trên toàn mặt thạch Vi khuẩn không mọc trên toàn mặt thạch Vi khuẩn không mọc trên toàn mặt thạch Vi khuẩn không mọc trên toàn mặt thạch
3 MRSA Vi khuẩn không
mọc trên toàn mặt thạch Vi khuẩn không mọc trên toàn mặt thạch Vi khuẩn không mọc trên toàn mặt thạch Vi khuẩn không mọc trên toàn mặt thạch 4 Staphylococcus aureus Vi khuẩn không mọc trên toàn mặt thạch Vi khuẩn không mọc trên toàn mặt thạch Vi khuẩn không mọc trên toàn mặt thạch Vi khuẩn không mọc trên toàn mặt thạch 5 Streptococcus feacium 9 13 8 8 Nhận xét
Tinh dầu nguyên chất của bốn loại rau th ơm kể trên ức chế hoàn toàn 7/11 chủng VK nghiên cứu.
Khẳng định một lần nữa tác động của tinh dầu lên các chủng VK Gram dương mạnh hơn lên các chủng VK Gram âm và cũng qua đó cho thấy khả năng kháng khuẩn của tinh dầu của rau tía tô t ương tự như đa số các loại rau thơm khác của Việt Nam.
Kết quả trên chưa cho phép khẳng định tinh dầu loại rau nào có hoạt tính kháng khuẩnmạnh hơn vìđiều này còn phụ thuộc vào khả năng hòa tan hay khuếch
tán trong môi trường cũng như khả năng bay hơi của chúng, tuy nhiên qua kết quả sơ bộ ở trên, chúng tôi nhận thấy chỉ duy nhất tinh dầu kinh giới nguyên chất có khả năng kháng P.aeruginosa, mặc dù vậy, đường kính vòng vô khuẩn tương đối nhỏ (7 mm). Với Sreptococcus feacium, một vi khuẩn Gram dương, đường kính vòng vô khuẩn của tinh dầu kinh giới đo dược là lớn nhất (13 mm).
3.5.1.2. Dung dịch 5 % tinh dầu
Kết quả định tính sơ bộ khả năng kháng khu ẩn của dung dịch 5 % tinh dầu tía tô so với một số loại rau thơm được thể hiện trên bảng 3.11 và 3.12
Bảng 3.11 Kết quả định tính s ơ bộ khả năng kháng khuẩn Gram âm của dung
dịch 5% tinh dầutía tô so với một số loại rau thơm
Đường kính vòng vô khuẩn (mm)
Stt VK Gram âm
Tía tô Kinh giới Húng quế Húng cay
1 E.coli 7 - - - 2 Klebsiella 7 - - - 3 Proteus 7 7 7 7 4 P.aeruginosa - - - - 5 Salmonella typhi - - - - 6 Shigella 8 8 7 8
Bảng 3.12 Kết quả định tính s ơ bộ khả năng kháng khuẩn Gram d ương của