CHƯƠNG 2: PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1.Nghiên cứu tác dụng ức chế xanthin oxidase [39]
Xanthin oxidase (XO) có tác dụng xúc tác phản ứng oxy hóa xanthin thành acid uric, đồng thời hình thành gốc tự do. Ta sử dụng phương pháp trắc quang để khảo sát khả năng ức chế enzym XO của các mẫu thử thông qua mật độ quang của sản phẩm acid uric hình thành. Acid uric có bước sóng hấp thu cực đại tại 290 nm. Chất có khả năng ức chế XO càng cao thì càng ức chế sự hình thành acid uric, do đó mật độ quang đo được sẽ giảm.
Chuẩn bị hóa chất:
Đệm phosphat 70 mM, pH = 7,5: cân 3,702 g NaH2PO4.2H2O và 16,57 g Na2HPO4.12H2O định mức thành 1000 ml bằng nước cất 2 lần. Dùng NaOH và H3PO4 điều chỉnh pH đến 7,5 bằng máy pH.
Xanthin oxidase 0,05 U/ml: pha từ XO 25 U/ml theo nguyên tắc pha loãng (1 unit (U) của XO được định nghĩa là lượng enzym cần thiết để tạo ra 1 µmol của acid uric trong 1 phút ở 250C).
Xanthin 150 µM: cân chính xác 1,14 mg xanthin, pha trong bình định mức 50 ml bằng đệm phosphat 70 mM, pH = 7,5.
HCl 1N: rút 16,7 ml HCl đậm đặc (37%) thêm nước cất thành 200 ml. Dung dịch mẫu có nồng độ 500 mΜ.
Tương ứng với mỗi nồng độ mẫu thử ta làm một mẫu trắng (blank). Mẫu trắng tương tự như mẫu thử nhưng thay 100 μl XO bằng 100 μl đệm.
Để có cơ sở đánh giá hoạt tính của những mẫu chất khảo sát đối với enzym XO, chúng tôi sử dụng allopurinol – một hợp chất ức chế enzym XO rất tốt – làm chất đối chứng dương.
Mẫu khảo sát được cân sau đó sẽ được hòa tan trong dung dịch đệm phosphat, pH = 7,5. Mỗi mẫu thử được pha thành bốn nồng độ khác nhau: 100; 50; 25; 10 µM.
Sơ đồ 2.3. Quy trình thử hoạt tính ức chế XO
Khả năng chống oxy hóa của các hợp chất được tính dựa trên phần trăm ức chế (%I) được xác định theo công thức:
Với:
Ac là giá trị mật độ quang của dung dịch không có mẫu thử (control).
As là giá trị mật độ quang của dung dịch có chứa mẫu thử (sample).
Mỗi nồng độ được tiến hành 3 lần, ứng với mỗi nồng độ ta tính được 3 giá trị phần trăm ức chế (% I). Lấy trung bình 3 giá trị %I từ đó ta sẽ xác
định được giá trị phần trăm ức chế ứng với từng nồng độ khảo sát. Nếu hoạt tính của mẫu thử ức chế trên 50% ở 10 µM thì sẽ được thử tiếp ở các nồng độ nhỏ hơn 5; 2; 1; 0,5; 0,2 µM để tìm ra giá trị IC50.
IC50 và cách xác định
Định nghĩa: IC50 là một giá trị dùng để đánh giá khả năng ức chế mạnh hoặc yếu của mẫu khảo sát. IC50 được định nghĩa là nồng độ của mẫu mà tại đó nó có thể ức chế 50% gốc tự do hoặc enzym. Mẫu có hoạt tính càng cao thì giá trị IC50 sẽ càng thấp.
Cách xác định IC50:
Tiến hành khảo sát hoạt tính của mẫu ở nhiều nồng độ khác nhau.
Với những mẫu có hoạt tính biến thiên tuyến tính với nồng độ, chúng ta vẽ một đường thẳng y = ax + b qua tất cả các điểm (với y là % ức chế và x là nồng độ).
Với những mẫu có hoạt tính không biến thiên tuyến tính với nồng độ, một cách gần đúng, chúng ta chọn 2 nồng độ ức chế trên và dưới 50% và cũng tiến hành vẽ đường thẳng y = ax + b. Ta sẽ thu được phương trình y = ax + b với 2 hệ số a, b đã biết.
Thay y = 50% vào phương trình ta sẽ thu được giá trị x. Đó chính là nồng độ ức chế được 50% gốc tự do (IC50).