Nhìn vào kết quả điện di exon 15 (Hình 32) chúng tôi phát hiện một mô hình sai khác trên mẫu số 4 so với mẫu đối chứng. Bởi vì, trong khi các mẫu phân tích thể hiện 2 băng trong khu vực sợi đơn thì mẫu số 4 chỉ xuất hiện một băng duy nhất ở vị trí tương ứng. Chúng tôi nghi ngờ mẫu số 4 có thể đã xảy ra đột biến nên mới có mô hình sợi đơn thể hiện bất thường như vậy. Đối chiếu lý lịch mẫu, mô hình sai khác này là của một bệnh nhân nữ, 51 tuổi được chẩn đoán mắc ung thư đại tràng.
Chúng tôi đã tiến hành điện di một lần nữa để có thêm cơ sở khẳng định nhận định đưa ra. Để biết chính xác mẫu có xảy ra đột biến hay không, vị trí đột biến ở đâu và đột biến thuộc dạng nào, chúng tôi gửi mẫu đi đọc trình tự trước khi tinh sạch mẫu và làm giàu nồng độ ADN nhờ kỹ thuật PCR. Sau khi phân tích và đối chiếu với mẫu đối chứng, chúng tôi chưa phát hiện chính xác vị trí xảy ra đột biến cũng như dạng đột biến dẫn tới mô hình điện di sai khác trên mẫu số 4 của exon này.
Tuy nhiên, trên exon 15 gen MSH2 cũng thuộc người Việt Nam, chúng tôi đã phát hiện một mô hình sai khác số lượng băng sợi đơn ở mẫu số 19 (Hình 33).
Kết quả giải trình tự mẫu số 19 phát hiện một đột biến dạng thay thế C>A ở codon 848 (c.848 C>A) (Hình 34). Đây là một đột biến đồng nghĩa. Bởi vì, việc thay thế nucleotide C bởi A không làm thay đổi axit amin trong chuỗi polypeptide do gen MSH2 tạo ra mà chỉ thay đổi bộ ba mã sao GCC → GCA tương ứng với bộ ba mã hóa CGG → CGU trên mARN. Hai bộ ba này cùng mã hóa axit amin arginin. Dựa trên cấu trúc protein của gen MSH2, sản phẩm protein của các exon 13, 14 và 15 tạo miền tương tác với dạng tương đồng MutL đóng một vai trò quan
nghĩa nên sản phẩm protein do exon 15 tạo ra không hề thay đổi. Chính vì thế chức năng miền tương tác với dạng tương đồng MutL không bị thay đổi.
Ngoài ra, theo những nghiên cứu trước đây, nhiều đột biến trong exon 15 gen
MSH2 đã được phát hiện. Cụ thể, trong năm 2005, Mangold và cộng sự đã tìm thấy 3 đột biến vô nghĩa c.2536 C>T (p.Gln846X), c.2575 G>T (p.Glu859X), và c.2579 C>A (p.Ser860X) [18]. Trong năm 2009, Salehi phát hiện hai đột biến tại vị trí khung đọc 2556 và 2586 [28]. Những đột biến này nằm cách xa vị trí đột biến được tìm thấy trong bệnh nhân 62 tuổi của Việt Nam tương ứng khoảng 13 đến 43 nucleotide.
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN
Từ những kết quả nghiên cứu thu được, chúng tôi đi tới một số kết luận sau: 1. Đã nhân bản thành công 09 trong tổng số 16 exon gen MSH2 nhờ kỹ thuật
PCR, bao gồm: thiết kế các cặp mồi đặc hiệu, tối ưu các thành phần phản ứng và nhiệt độ gắn mồi cho các exon 2, 3, 6, 7, 8, 12, 13, 14 và 15.
2. Sử dụng kỹ thuật PCR-SSCP trong phân tích đột biến trên các exon lựa chọn, chúng tôi đã phát hiện được 8 mô hình điện di sai khác ở 8 bệnh nhân. Trong đó, 1 mô hình thuộc exon 2, 1 mô hình thuộc exon 3, 1 mô hình thuộc exon 7, 3 mô hình thuộc exon 8 và 2 mô hình thuộc exon 15.
3. Giải trình ADN các exon gen MSH2 từ các mẫu có mô hình PCR-SSCP sai khác, chúng tôi phát hiện 3 đột biến bao gồm: một đột biến mất nucleotide A tại vị trí 5193 (vùng intron nằm trước exon 2 gen MSH2); một đột biến thay thế nucleotide tại vị trí codon 199 nucleotide G bị thay thế bởi T (c.199 G>T) ở exon 3 dẫn tới thay đổi axit amin prolin (CCG) thành axit amin glutamin (CAG) trong chuỗi polypeptide do gen MSH2 tạo ra và một đột biến thay thế C>A tại vị trí 77942 (tương ứng codon 848 trên exon 15) thuộc gen MSH2.
KIẾN NGHỊ
Trên cơ sở những kết quả trên, chúng tôi có một số kiến nghị sau:
1. Tiếp tục phân tích di truyền trên các exon còn lại của gen MSH2 để có kết luận chung nhất về sự di truyền ung thư đại trực tràng do đột biến gen MSH2
2. Mở rộng hướng nghiên cứu với các gen còn lại thuộc hệ thống MMR để có cơ sở dữ liệu chung nhất trong chẩn đoán sớm ung thư đại trực tràng.
3. Áp dụng một vài phương pháp khác như HET và DGGE nhằm làm tăng hiệu quả phân tích tính di truyền và sàng lọc đột biến.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tài liệu tiếng Việt
1. Trịnh Đình Đạt (2009), Công nghệ sinh học, Tập 4, NXB Giáo Dục, Hà Nội. 2. Võ Thị Thương Lan (2009), Giáo trình sinh học phân tử tế bào và ứng dụng,
NXB Giáo dục.
3. Đinh Đoàn Long, Đỗ Lê Thăng (2009), Cơ sở Di truyền học Phân tử và Tế bào, NXB Đại học Quốc gia Hà Nội, Hà Nội.
4. Đinh Đoàn Long, Nguyễn Thị Hồng Vân, “Cơ sở Di truyền học Ung thư” (Tài liệu đang in).
5. Hoàng Thị Sèn (2005), Giáo trình giải phẫu người, Đại học Thái Nguyên. 6. Lê Duy Thành (2006), Cơ sở di truyền chọn giống thực vật, NXB Khoa học
và Kỹ thuật, Hà Nội.
7. Đỗ Lê Thăng, Quyền Đình Thi, Nguyễn Mộng Hùng, Nguyễn Huỳnh Minh Quyên, Nguyễn Chí Thành (2009), Công nghệ sinh học phân tử - Nguyên lý và ứng dụng của ADN tái tổ hợp – Bernard R. Glick, Jack J. Pasternak, NXB Khoa học và Kỹ thuật, (tr43).
Tài liệu tiếng Anh
8. Aarnio M, Sankila R, Pukkala E, Salovaara R, Aaltonen L, de la Chapelle A, Peltomäki P, Mecklin J-P, Järvinen H (1999), “Cancer risk in mutation carriers of DNA mismatch repair genes”, Int J Cance, 81, pp. 214–218. 9. Cecily PV, Elaine L, Wade SS (2008), “Confirmation of single exon
deletions in MLH1 ADN MSH2 using quantitative PCR”, ARUP institute for clinical ADN Experimental pathology, Salt Lake City.
10.Chapman Anthony Hugh & Jean François Adell (2004). Radiology and imaging of the colon. Springer. ISBN: 3540435972, 9783540435976.
11.De la Chapelle A (2004), “Genetic Predisposition to Colorectal Cancer: Lynch Syndrome (HNPCC)”, Nature Publishing Group , Nat Rev Cancer, 4(10).
12.Hendriks YM, de Jong AE, Morreau H, et al (2006), “Diagnostic approach ADN management of Lynch syndrome (hereditary nonpolyposis colorectal carcinoma): a guide for clinicians”, CA Cancer J Clin,56(4), pp. 213-238. 13.Huang J, Kuismanen SA, Liu T, et al (2001), “MSH6 and MSH3 are rarely
involved in genetic predisposition to nonpolypotic colon cancer”, Cancer Res,61(4), pp. 1619-1623.
14.Iaccarino I, Marra G, Palombo F, Jiricny J (1998), “hMSH2 and hMSH6 play distinct roles in mismatch binding ADN contribute differently to the ATPase activity of hMutSalpha”, EMBO J, 17(9), pp. 2677-2686.
15.Jiricny J (2000), “Mediating mismatch repair”, Nat Genet, 24(1), pp. 6-8. 16.Loukola A, Vilkki S, Singh J, Launonen V, Aaltonen LA (2000), “Germline
ADN somatic mutation analysis of MLH3 in MSI-positive colorectal cancer”, Am J Pathol, 157(2), pp. 347-352.
17.Lynch, H. T., Smyrk, T., Watson, P., Lanspa, S. J., Boman, B. M., Lynch, P. M., Lynch, J. F., Cavalieri (1991), “Hereditary colorectal cancer”. Semin. Oncol, 18: 337 – 366.
18.Mangold E. et al. 2005. Spectrum and frequencies of mutations in MSH2 and MLH1 identified in 1,721 German families suspected of hereditary nonpolyposis colorectal cancer. Int. J. Cancer: 116, 692–702.
19.Manuel Perucho, “Genetic and Epigenetic Modification of MLH1” (2000),
American Journal of Pathology, 157:1052-1053.
20.Minna Nyström-Lahti, Ramon Parsons, Pertti Sistonen, Lea Pylkkänen, Lauri A. Aaltonen, Fredrick S. Leach, Stanley R. Hamilton, Patrice Watson, Earlene Bronson, Ramon Fusaro, Jennifer Cavalieri, Jane Lynch, Stephen Lanspa, Tom Smyrk, Patrick Lynch, Thomas Drouhard, Kenneth W. Kinzler, Bert Vogelstein, Henry T. Lynch, Albert de la Chapelle, and Päivi Peltomäki (1994), “Mismatch Repair Genes on Chromosomes 2p and 3p Account for a Major Share of Hereditary Nonpolyposis Colorectal Cancer Families Evaluable by Linkage”, Am J Hum Genet, 55(4): 659–665.
21.Modrich P (2006), “Mechanisms in eukaryotic mismatch repair”, J Biol Chem, 281(41), 30305-30309.
22.Myers RM, Maniatis T, Lerman LS. Detection and localization of single base changes by denaturing gradient gel electrophoresis. Methods Enzymol. 155: 501-527, 1987.
23.Ohmiya N, Matsumoto S, Yamamoto H, Baranovskaya S, Malkhosyan SR, Perucho M (2001), “Germline ADN somatic mutations in hMSH6 ADN hMSH3 in gastrointestinal cancers of the microsatellite mutator phonotype”
Gene, 272(1-2), pp. 301-313.
24.Orita M, Iwahana H, Kanazawa H, Hayashi K, Sekiya T (1989), “Detection of polymorphism of human DNA by gel electrophoresis as single strand conformation polymorphism”, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, pp. 2766- 2770.
25.Papp J, Kovacs ME, Olah E (2007), “Germline MLH1 ADN MSH2 mutational spectrum including frequent large genomic aberrations in
Hungarian hereditary non-polyposis colorectal cancer families: implications for genetic testing”, World J Gastroenterol,13(19), pp. 2727-2732.
26.Peltomäki P (2005), “Lynch syndrome genes”, Fam Cancer, 4(3), pp. 227- 232.
27.Peltomäki P, Vasen HF (1997), “Mutations predisposing to hereditary nonpolyposis colorectal cancer: database ADN results of a collaborative study”, The International Collaborative Group on Hereditary Nonpolyposis Colorectal Cancer, Gastroenterology, 113(4), pp. 1146-1158.
28.Salehi M, Amani S, Javan S, Emami M. H, Salamat M. R, and Noori Daloii M. R. 2009 Evaluation of MLH1 and MSH2 Gene Mutations in a Subset of Iranian Families with Hereditary Nonpolyposis Colorectal Cancer (HNPCC).
Journal of Sciences, Islamic Republic of Iran 20(1): 7-12.
29.Screening for Lynch Syndrome by Microsatellite Instability Analysis and Immunohistochemistry – Jason D. Merker, MD, PhD,CAP Molecular Oncology Committee.
30.Stewart B. W. and Kleihues P. (2003), “World Cancer Report”, IARC Press, Lyon.
31.Vasen HF, Mecklin JP, Khan PM, Lynch HT (1991), “The International Collaborative Group on Hereditary Non-Polyposis Colorectal Cancer (ICG- HNPCC)”, Dis Colon Rectum, 34(5), pp. 424-425.
32.Vasen HF, Watson P, Mecklin JP, Lynch HT (1999), “New clinical criteria for hereditary nonpolyposis colorectal cancer (HNPCC, Lynch syndrome) proposed by the International Collaborative group on HNPCC”,
Gastroenterology, 116(6), pp. 1453-1456.
34.Warthin, A.S (1925), “The further of study of a cancer family”, J. Cancer Res, 279 – 286.
35.Watson P , Lynch HT, Shaw TG, et al. (1999), “Clinical impact of molecular genetic diagnosis, genetic counseling, and management of hereditary cancer. Part I: Studies of cancer in families”, Cancer, 86(11 Suppl), pp. 2449-2456. 36.Yamashita, K., Dai, T., Dai, Y., Yamamoto, F., Perucho (2003), “Genetics
supersedes epigenetics in colon cancer phenotype”, Cancer Cell, 4: 121-131. 37.Zhang H, Zhang YZ, Zhang MZ, Sheng JQ, Fu L, Huang JS, Han M, Mu H,
Li AQ, Wu ZT, Han Y, Li SR (2008), “Mismatch repair gene mutations in Chinese HNPCC patients”, Cytogenet Genome Res, 122, pp. 22-27.
Các trang Web 38.http://atlasgeneticsoncology.org 39.http://biosiva.50webs.org 40.http://ghr.nlm.nhi.gov/gene/MSH2 41.http://openi.nlm.nhi.gov 42.http://www.bookrags.com/research/heteroduplex-analysis-wog/ 43.http://www.genetests.org 44.http://www.mayoclinic.com 45.http://www.ncbi.nlm.nih.gov