Đây là phương pháp được ứng dụng để đọc trình tự một đoạn ADN với một kích thước nhất định dựa vào sắc đồ bắt màu của các bazơ nitơ. Tuy không có ý nghĩa trong sàng lọc đột biến nhưng nó là khâu cuối cùng khẳng định đột biến có
biến. Cùng một số phần mềm hỗ trợ phân tích kết quả giải trình tự như BioEdit, Xplorer v2.4.2 và Genetyx-Win 4.0 các dạng đột biến cũng được phát hiện.
Phương pháp này tuy tốn kém nhưng cho hiệu quả cao trong việc khẳng định kết quả nghiên cứu. Giải trình tự ADN cũng là phương pháp không thể thiếu trong những nghiên cứu liên quan đến phân tích di truyền ở cấp độ phân tử như phát hiện đột biến, phân biệt, định danh các loài.
Với những mẫu có mô hình điện di sai khác được chỉ ra nhờ kỹ thuật PCR- SSCP, chúng tôi tinh sạch và làm giàu nồng độ bằng phản ứng PCR trước khi gửi mẫu đi giải trình tự. Kết quả giải trình tự các phân đoạn gen trong mẫu bệnh nhân được phân tích bằng phần mềm BioEdit và Genetyx-Win 4.0 và được so sánh với trình tự tương ứng từ mẫu đối chứng.
Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. KẾT QUẢ TÁCH CHIẾT ADN TỔNG SỐ
ADN tổng số được tinh sạch theo quy trình hướng dẫn đi kèm trong bộ Kit tách chiết. Sau khi tiến hành các thao tác được chỉ dẫn, chúng tôi đã thu được sản phẩm ADN tổng số từ 42 mẫu bệnh phẩm tương ứng và ADN tổng số của 5 mẫu đối chứng (Hình 10). Sản phẩm tách chiết được điện di trên gel agarose 0,8%, pha và điện di trong môi trường đệm TAE 1X khoảng 40 – 45 phút với điện thế nguồn 80V. Nhờ thang chuẩn λ/HindIII làm chỉ thị, chúng tôi thu được một băng duy nhất trên bản gel với kích thước xấp xỉ 23,1Kb. Kết quả cho thấy, ADN tổng số đã được tách chiết thành công.
Nhìn vào Hình 10 ta thấy, ADN tổng số thu được có chất lượng khá đồng đều ở hầu hết các mẫu. Cụ thể, các băng ADN có độ sáng cao, gọn và sắc nét, không bị đứt gãy, lẫn rất ít hoặc không lẫn ARN. Sau khi đo hàm lượng ADN nhờ
hệ thống máy đo quang phổ hấp thụ tại 2 điểm có bước sóng lần lượt là 260nm và 280nm, chúng tôi thu được chỉ số OD260/280 dao động trong khoảng 1,6 – 2, tương ứng với hàm lượng ADN trong khoảng 300 – 500 µg/ml. Đây là những chỉ số phù hợp với yêu cầu về chất lượng ADN cho các bước thí nghiệm tiếp theo. Các mẫu ADN tổng số thu được được pha loãng với nước khử ion tới nồng độ 100µg/ml và bảo quản trong tủ lạnh ở nhiệt độ -200C.
3.2. KẾT QUẢ NHÂN BẢN 09 EXON GEN MSH2
Với những hiểu biết cơ bản về nguyên lý hoạt động của phản ứng PCR, tối ưu hóa được thành phần phản ứng, tìm được điểm gắn mồi phù hợp cho mỗi exon, chúng tôi đã nhân bản thành công các exon quan tâm. Kết quả nhân bản 09 exon bao gồm exon 2, 3, 6, 7, 8, 12, 13, 14, 15 được chúng tôi kiểm tra nhờ phương pháp điện di trên gel agarose 1,2% pha và chạy trong môi trường đệm TAE 1X ở điện thế nguồn 90V với thời gian khoảng 30 phút. Nhờ thang chuẩn marker 100bp làm chỉ thị, chúng tôi đã thu được sản phẩm nhân bản có kích thước phù hợp với từng exon tương ứng. Chi tiết kết quả nhân bản các exon được thể hiện trong các hình từ Hình 11 – 19.
3.2.1. Kết quả nhân bản exon 2
Exon 2 được chúng tôi tiến hành tối ưu hóa điều kiện nhiệt độ gắn mồi từ 500 đến 520C, chia thành 5 điểm là 500C, 50.50C, 510C, 51.50C, 520C. Trong đó, ở điểm nhiệt 500, ngoài băng chính có kích thước 345bp, chúng tôi thấy xuất hiện thêm một băng sản phẩm phụ kích thước >345bp. Với 3 điểm nhiệt 50.50C, 510C, 51.50C chỉ có duy nhất 1 băng có kích thước xấp xỉ 345bp. Nhưng ở điểm nhiệt 510
C băng ADN thể hiện độ sáng cao nhất. Chúng tôi đã quyết định sử dụng điểm nhiệt độ gắn mồi 510C trong nhân bản exon 2. Sau khi nhân bản đồng loạt các mẫu, kết quả điện di được thể hiện như Hình 11. Kết quả cho thấy, exon 2 gen MSH2 của 42 mẫu bệnh phẩm đã được chúng tôi nhân bản thành công.
3.2.2. Kết quả nhân bản exon 3
Exon 3 được chúng tôi tối ưu hóa điều kiện nhiệt độ gắn mồi trong dải nhiệt từ 560 đến 580C, chia thành 5 điểm là 560C, 56.50C, 570C, 57.50C, 580C . Ở điểm nhiệt 560C ngoài băng chính với kích thước khoảng 281 bp chúng tôi thấy xuất hiện 1 băng phụ phía trên với kích thước >900 bp. Ở 3 điểm nhiệt còn lại là 56.50C, 570C và 57.50
C chỉ có duy nhất 1 băng ADN với kích thước đúng yêu cầu của sản phẩm nhân bản. Tuy nhiên, trong 3 điểm nhiệt thử nghiệm có cùng kết quả này chúng tôi thấy, băng ADN có độ sáng cao nhất thuộc điểm nhiệt 570C. Vì vậy, chúng tôi quyết định chọn điểm nhiệt 570C làm nhiệt độ gắn mồi nhân bản exon 3 và không thử nghiệm với điểm nhiệt 580C. Các mẫu được nhân bản thành công với kết quả điện di được thể hiện như Hình 12. Kết quả điện di cho thấy, exon 3 đã được chúng tôi nhân bản thành công với kích thước sản phẩm đúng theo tính toán lý thuyết được đề cập trong Bảng 6.
3.2.3. Kết quả nhân bản exon 6
Căn cứ vào tỷ lệ GC trong trình tự mồi kết hợp với tính toán lý thuyết nhiệt độ gắn mồi, chúng tôi đã xác định, dải nhiệt độ gắn mồi để nhân bản exon 6 nằm trong khoảng từ 520C đến 530C, chia thành 3 điểm là 520
C, 52.50C và 530
C. Ở điểm nhiệt 520C, ngoài băng chính với kích thước xấp xỉ 279bp còn xuất hiện 1 băng phụ phía dưới kích thước >150bp. Với điểm 52.50C, băng phụ mờ hơn, băng chính lên sáng rõ. Ở điểm nhiệt cuối cùng là 530C, chúng tôi thu được duy nhất 1 băng với kích thước ~279bp. Chúng tôi đã quyết định sử dụng điểm nhiệt 530C làm nhiệt độ gắn mồi trong nhân bản exon 6. Kết quả điện di sản phẩm nhân bản exon 6 của các mẫu được thể hiện như Hình 13.
3.2.4. Kết quả nhân bản exon 7
Trong nhân bản exon 7, khi so sánh độ dài, tỷ lệ %GC của mồi và kích thước exon nhân bản chúng tôi thấy tương đối giống exon 12. Vì thế, chúng tôi quyết định chọn điểm nhiệt độ gắn mồi trong nhân bản exon 7 là 560C (giống với nhiệt độ gắn mồi exon 12 mục 3.2.6). Kết quả điện di cho thấy, ở 560C chúng tôi thu được 1 băng ADN duy nhất với kích thước khoảng 351bp. Điều đó khẳng định, exon 7 đã được chúng tôi nhân bản thành công. Kết quả nhân bản exon 7 cho 42 mẫu nghiên cứu được thể hiện như Hình 14.
3.2.5. Kết quả nhân bản exon 8
Căn cứ vào trình tự mồi cũng như nhiệt độ gắn mồi tính toán theo lý thuyết, chúng tôi dự kiến nhiệt độ gắn mồi trong nhân bản exon 8 nằm trong dải từ 540C đến 560
C. Tiến hành thử nghiệm với 3 điểm nhiệt là 540C, 550C và 560C, chúng tôi thu được kết quả như sau: ở 540C, ngoài băng ADN có kích thước khoảng 365bp còn xuất hiện 1 băng phụ mờ với kích thước >100bp; ở 550
C chỉ xuất hiện 1 băng ADN duy nhất có kích thước khoảng 365bp; ở 560C không còn băng ADN nào được thể hiện. Điều đó chứng tỏ, 550C là điểm nhiệt gắn mồi tối ưu trong nhân bản exon 8. Hình 15 là kết quả nhân bản exon 8 cho 42 mẫu nghiên cứu.
3.2.6. Kết quả nhân bản exon 12
Exon 12 được tối ưu hóa điều kiện nhiệt độ gắn mồi nằm trong dải từ 550
C đến 570C với 4 điểm nhiệt được thử nghiệm là 550C, 560C, 56.50C và 570C. Ở điểm nhiệt 550C, băng ADN chính với kích thước khoảng 369bp lên sáng rõ nhưng ngoài ra xuất hiện 2 băng phụ mờ (trong đó 1 băng có kích thước >250bp và 1 băng có kích thước <100bp). Khi tăng nhiệt độ gắn mồi lên 560C thì băng phụ kích thước >250 bp không còn xuất hiện, chỉ còn băng <100bp. Chúng tôi nhận định đây có thể là lượng mồi còn dư sau thử nghiệm. Vì ở điểm nhiệt 56.50C băng chính không còn xuất hiện, chỉ có băng <100bp được thể hiện. Chúng tôi không tiến hành thử nghiệm ở điểm nhiệt độ 570C và chọn 560C làm nhiệt độ gắn mồi tối ưu trong nhân bản exon 12. Ngoài ra, để hạn chế sự xuất hiện băng ADN kích thước <100bp, chúng tôi giảm lượng mồi bổ sung trong thành phần phản ứng. Điều kiện thử
nghiệm cũng như kết quả nhân bản exon 12 của các mẫu được thể hiện như Hình 16.
3.2.7. Kết quả nhân bản exon 13
Dựa trên những tính toán lý thuyết về nhiệt độ gắn mồi của exon 13, chúng tôi dự kiến nhiệt độ gắn mồi nhân bản exon 13 nằm trong dải từ 530C đến 540
C. Thử nghiệm với 3 điểm nhiệt gắn mồi là 530C, 53.50C và 540C, chúng tôi thu được kết quả như sau: ở điểm nhiệt 530C ngoài băng ADN chính mờ với kích thước 244bp còn xuất hiện 1 băng phụ mờ với kích thước ~400bp; ở điểm nhiệt 53.50C băng phụ kích thước ~400bp không còn nhưng băng chính vẫn mờ; ở điểm nhiệt 540C băng ADN chính lên sáng rõ và không xuất hiện băng phụ nào. Vì vậy, chúng tôi quyết định chọn điểm nhiệt 540C làm nhiệt độ gắn mồi tối ưu trong nhân bản exon 13. Hình 17 cho thấy, exon 13 đã được chúng tôi nhân bản thành công.
3.2.8. Kết quả nhân bản exon 14
Chúng tôi tiến hành tối ưu hóa điều kiện nhiệt độ găn mồi exon 14 trong dải từ 510C đến 530C và được thử nghiệm ở 3 điểm nhiệt là 510C, 520C và 530C. Trong 3 điểm nhiệt thử nghiệm này, chúng tôi quyết định sử dụng điểm nhiệt 520C để nhân bản exon 14. Vì ở điểm nhiệt này, chúng tôi thu được sản phẩm PCR đúng với kích thước mong muốn ~315bp với độ sáng cao, không có băng phụ xuất hiện. Kết quả nhân bản exon 14 cho các mẫu được thể hiện như Hình 18.
3.2.9. Kết quả nhân bản exon 15
Exon 15 được chúng tôi tối ưu điều kiện nhiệt độ gắn mồi sử dụng để nhân bản nằm trong dải nhiệt từ 520C đến 540C ở 3 điểm nhiệt gắn mồi là 520C và 530C và 53.50
C. Ở điểm nhiệt đầu tiên là 520C, chúng tôi không thu được băng ADN nào. Còn ở điểm nhiệt thứ hai là 530C, chúng tôi thu được 1 băng ADN với kích thước khoảng 235bp. Đây chính là kích thước đoạn gen mà chúng tôi cần nhân bản. Khi tăng thêm 0.50
C nữa, băng chính xuất hiện khá mờ so với điểm nhiệt 530C. Vì vậy, chúng tôi quyết định chọn 530C làm điểm nhiệt gắn mồi để nhân bản exon 15. Điều kiện thử nghiệm cũng như kết quả nhân bản exon 15 được thể hiện trong Hình 19.
Nhìn vào những hình ảnh minh họa nêu trên (từ Hình 11 đến Hình 19), chúng tôi có thể khẳng định sự thành công của kỹ thuật PCR sử dụng trong nhân bản các exon. Hơn nữa, chúng tôi cũng khẳng định nhiệt độ gắn mồi của các exon đã được tối ưu hóa (chi tiết xem trong Bảng 10). Bởi kết quả điện di cho thấy, trên bản gel chỉ xuất hiện một băng ADN duy nhất đúng kích thước tương ứng với mỗi exon và không có sản phẩm phụ. Hơn nữa, các băng ADN thu được có độ sáng cao, gọn, sắc nét. Mẫu đối chứng dương (kí hiệu là D trên bản gel – là sản phẩm nhân bản từ ADN của người được khẳng định không mắc ung thư đại trực tràng cũng như các bệnh ung thư khác có liên quan đến hệ tiêu hóa) cũng được chúng tôi nhân bản thành công với một băng duy nhất, đáp ứng tiêu chuẩn cần thiết của mẫu dùng làm đối chứng. Riêng đối chứng âm (kí hiệu là (-) trên bản gel – là sản phẩm PCR khuyết ADN) không được thể hiện sau điện di. Chứng tỏ, các mẫu không bị lẫn nhiễm với nhau trong quá trình thao tác và hóa chất cũng như dụng cụ sử dụng
trong phản ứng PCR được đảm bảo chất lượng. Vì thế chúng tôi đã chọn những sản phẩm nhân bản thành công này làm nguyên liệu cho bước phân tích và phát hiện đột biến nhờ phương pháp SSCP.
Bảng 10: Kết quả tối ưu điều kiện nhiệt độ gắn mồi trong nhân bản các exon nghiên cứu
Tên exon Nhiệt độ gắn mồi (0C) Tên exon Nhiệt độ gắn mồi (0C)
2 51 12 56
3 57 13 54
6 53 14 52
7 56 15 53
8 55
3.3. KẾT QUẢ PHÂN TÍCH ĐỘT BIẾN TRÊN 09 EXON GEN MSH2
Chúng tôi tiến hành sàng lọc đột biến trên 09 exon lựa chọn của gen MSH2 ở tất cả các mẫu nghiên cứu. Dựa trên kỹ thuật SSCP theo Orita và cộng sự (1989) [24], chúng tôi đã lựa chọn được nồng độ gel phân tích phù hợp với kích thước các phân đoạn gen quan tâm, tối ưu hóa được các điều kiện thí nghiệm và hoàn thiện được quy trình nhuộm bạc nhanh sản phẩm điện di để có kết quả tốt nhất (Mục 2.3.4). Ở các exon có mẫu nghi ngờ xảy ra đột biến, chúng tôi tiến hành điện di thêm một lần nữa để khẳng định chắc chắn những nhận định có được trước khi gửi mẫu đi giải trình tự. Kết quả phân tích đột biến 09 exon lựa chọn được thể hiện dưới đây.
3.3.1. Kết quả phân tích đột biến exon 2
Nhìn vào Hình 20 ta thấy, sản phẩm PCR các mẫu thuộc exon 2 đã được biến tính thành công. Sự thể hiện mô hình điện di của các băng ADN trong khu vực sợi đơn xuất hiện khá rõ với 3 băng tách biệt nhau. So sánh số lượng băng cũng như kích thước và khoảng cách giữa các băng với mẫu đối chứng chúng tôi thấy không có sự bất thường nào xảy ra. Điều đó chứng tỏ, không có đột biến nào xảy ra trên exon 2 ở 42 mẫu được phân tích.
Tuy nhiên trên exon 2 gen MSH2 cũng thuộc người Việt Nam, chúng tôi đã phát hiện một mô hình điện di sợi đơn sai khác trên mẫu 35 (Hình 21). Trong mô
hình điện di thu nhận được từ các mẫu phân tích, ngoài 3 băng ADN sợi đơn giống mẫu đối chứng, ở mẫu 35 xuất hiện thêm 2 băng sợi đơn phía dưới một cách bất thường. Chúng tôi đã tiến hành gửi mẫu 35 giải trình tự sau khi nhận định mẫu 35 có thể mang những biến đổi về trình tự ADN.
Kết quả giải trình tự (Hình 22) và so sánh với trình tự tương ứng ở mẫu đối chứng cho thấy có một đột biến mất một nucleotide A tại vị trí 5193 trên intron cách exon 2 khoảng 15 nucleotide ngược dòng (tức là nằm trong vùng ranh giới exon 1 và exon 2). Sự thay đổi trong vùng ranh giới này có thể dẫn đến sự thay đổi ở vùng trước của phân tử mARN từ đó ảnh hưởng đến quá trình biến đổi sau phiên mã. Tuy
xảy ra ở trình tự poly A được lặp lại 13 lần. Rất có thể đây là một dạng bất ổn vi vệ tinh đã được đề cập trong cơ sở phân tử của ung thư đại trực tràng.
Đây được xem là phát hiện khá thú vị và mang giá trị thiết thực trong chẩn đoán lâm sàng bệnh ung thư đại trực tràng nói riêng, HNPCC nói chung. Bởi vì, những đột biến này xảy ra ngay trong intron – vùng ranh giới giữa các exon, nơi mà chúng ta ít quan tâm hơn các vùng mã hóa khác trong toàn bộ cấu trúc hệ thống gen sửa chữa bắt cặp sai MMR.
3.3.2. Kết quả phân tích đột biến exon 3
Căn cứ vào Hình 23 ta thấy, ở các mẫu ADN phân tích trừ mẫu 14, mô hình điện di xuất hiện 3 băng sợi đơn. Trong đó, 2 băng phía trên nằm sát nhau và tách biệt với băng sợi đơn còn lại. Tuy nhiên, ở mẫu 14 chỉ xuất hiện 2 băng sợi đơn phía trên mà mất hoàn toàn băng sợi đơn phía dưới. Đối chiếu sự sai khác này với mẫu đối chứng, chúng tôi kết luận có thể mẫu 14 của exon 3 đã xảy ra đột biến nên mới có mô hình sợi đơn thể hiện bất thường như vậy. Hơn nữa, chúng tôi dự đoán,