Exon 15 được chúng tôi tối ưu điều kiện nhiệt độ gắn mồi sử dụng để nhân bản nằm trong dải nhiệt từ 520C đến 540C ở 3 điểm nhiệt gắn mồi là 520C và 530C và 53.50
C. Ở điểm nhiệt đầu tiên là 520C, chúng tôi không thu được băng ADN nào. Còn ở điểm nhiệt thứ hai là 530C, chúng tôi thu được 1 băng ADN với kích thước khoảng 235bp. Đây chính là kích thước đoạn gen mà chúng tôi cần nhân bản. Khi tăng thêm 0.50
C nữa, băng chính xuất hiện khá mờ so với điểm nhiệt 530C. Vì vậy, chúng tôi quyết định chọn 530C làm điểm nhiệt gắn mồi để nhân bản exon 15. Điều kiện thử nghiệm cũng như kết quả nhân bản exon 15 được thể hiện trong Hình 19.
Nhìn vào những hình ảnh minh họa nêu trên (từ Hình 11 đến Hình 19), chúng tôi có thể khẳng định sự thành công của kỹ thuật PCR sử dụng trong nhân bản các exon. Hơn nữa, chúng tôi cũng khẳng định nhiệt độ gắn mồi của các exon đã được tối ưu hóa (chi tiết xem trong Bảng 10). Bởi kết quả điện di cho thấy, trên bản gel chỉ xuất hiện một băng ADN duy nhất đúng kích thước tương ứng với mỗi exon và không có sản phẩm phụ. Hơn nữa, các băng ADN thu được có độ sáng cao, gọn, sắc nét. Mẫu đối chứng dương (kí hiệu là D trên bản gel – là sản phẩm nhân bản từ ADN của người được khẳng định không mắc ung thư đại trực tràng cũng như các bệnh ung thư khác có liên quan đến hệ tiêu hóa) cũng được chúng tôi nhân bản thành công với một băng duy nhất, đáp ứng tiêu chuẩn cần thiết của mẫu dùng làm đối chứng. Riêng đối chứng âm (kí hiệu là (-) trên bản gel – là sản phẩm PCR khuyết ADN) không được thể hiện sau điện di. Chứng tỏ, các mẫu không bị lẫn nhiễm với nhau trong quá trình thao tác và hóa chất cũng như dụng cụ sử dụng
trong phản ứng PCR được đảm bảo chất lượng. Vì thế chúng tôi đã chọn những sản phẩm nhân bản thành công này làm nguyên liệu cho bước phân tích và phát hiện đột biến nhờ phương pháp SSCP.
Bảng 10: Kết quả tối ưu điều kiện nhiệt độ gắn mồi trong nhân bản các exon nghiên cứu
Tên exon Nhiệt độ gắn mồi (0C) Tên exon Nhiệt độ gắn mồi (0C)
2 51 12 56
3 57 13 54
6 53 14 52
7 56 15 53
8 55