3. Nội dung nghiên cứu
2.2.3.Phƣơng pháp lây nhiễm bằng Agro-inoculation
(1) Gieo hạt và trồng cây thí nghiệm.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/
25
(3) Chuẩn bị vi khuẩn lây nhiễm: nuôi lắc các dòng khuẩn lây nhiễm C58/PC2300/TY (PCAMBIA 2300 mang vòng DNA – A genome TYLCV) và C58/PC2300/β (PCAMBIA 2300 mang vòng DNAβ vệ tinh của TYLCV) riêng biệt trên môi trƣờng LB lỏng bổ sung kháng sinh kanamycin và rifamycin, sau đó ly tâm thu cặn tế bào vi khuẩn và hòa từng dòng khuẩn vào dung dịch lây nhiễm (MgCl2 10 mM, MES 10 mM, AS 100 µM, H2O), cuối cùng trộn hai dòng khuẩn này lại với nhau với tỷ lệ 1 : 1, để ở nhiệt độ phòng 1 – 2 giờ rồi tiến hành tiêm cho các cây cà chua thí nghiệm.
(4) Tiến hành lây nhiễm bằng tiêm: Sau khi cây con cao khoảng 10 cm khỏe mạnh, tiến hành tiêm khoảng 5 ml/cây (OD dịch khuẩn 0,5 – 1). Lặp lại thí nghiệm 3 lần, mỗi lần cách nhau 10 ngày.
1.2.6. Phƣơng pháp quang phổ hấp thụ (đo quang phổ - đo OD)
Dung dịch tế bào vi khuẩn đƣợc đo OD bằng máy quang phổ ở bƣớc sóng 660 nm (OD660). Khi độ OD660 = 0,5 – 1 thì dịch khuẩn có thể dùng cho thí nghiệm lây nhiễm ở trên (mục 2.2.3).
DNA đƣợc đo bằng máy quang phổ ở bƣớc sóng 260 nm và 280 nm. Nồng độ DNA đƣợc tính theo công thức:
Nồng độ DNA (ng/µl) = OD260 × 50 × hệ số pha loãng. Độ sạch DNA = OD260/OD280.
Trong đó: OD260 là chỉ số đo đƣợc ở bƣớc sóng 260 nm, OD280 là chỉ số đo đƣợc ở bƣớc sóng 280 nm.
Nếu tỷ lệ OD260/OD280 = 1,8 – 2,0 thì DNA đó là tinh sạch.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/
26
Để xác định các mức độ biểu hiện bệnh chúng tôi căn cứ theo tiêu chí Lapidot và Friedman đƣa ra năm 2002. Theo tác giả, biểu hiện bệnh xoăn vàng lá do TYLCV đƣợc chia thành 5 mức độ từ 0 đến 4 (Hình 2.2).
0:Cây không nhiễm bệnh, sinh trưởng và phát triển bình thường. 1: Những lá trên đỉnh ngọn có biểu hiện vàng nhẹ ở mép lá. 2: Lá vàng và xoăn nhẹ ở mép lá. 3: Lá vàng, xoăn và cụp xuống đồng thời kích thước bị thu nhỏ lại. 4: Lá xoăn, kích thước lá thu nhỏ nhiều, cây cằn cỗi và ngừng sinh trưởng.
Hình 2.2. Các mức độ biểu hiện bệnh xoăn vàng lá cà chua
2.2.6. Phƣơng pháp phân tích sự có mặt của virus TYLCV 2.2.6.1. Thu thập mẫu và tách chiết DNA tổng số 2.2.6.1. Thu thập mẫu và tách chiết DNA tổng số
a, Thu thập và bảo quản mẫu
Dùng găng tay và kéo đã khử trùng bằng cồn, cắt lấy những lá non của các cây thí nghiệm nghi nhiễm bệnh xoăn vàng do TYLCV (thu mẫu vào thời điểm khô ráo). Các mẫu lá sau khi thu đƣợc bảo quản trong bình thuỷ tinh có chứa các hạt silica gel hút ẩm và bảo quản nơi khô ráo trong điều kiện nhiệt độ phòng.
b, Tách chiết DNA tổng số các mẫu lá.
Để tách chiết DNA tổng số của các mẫu cà chua chúng tôi tiến hành pha dung dịch đệm tách với nồng độ các chất theo công thức dƣới đây (Bảng 2.1).
Bảng 2.1. Nồng độ các hoá chất trong dung dịch đệm tách DNA tổng số
TT Nồng độ gốc Nồng độ dung dịch đệm
1 1M Tris-HCl pH =8,0 50mM
2 5M NaCl 300mM
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/
27
4 CTAB 4%
5 Nước khử ion, khử trùng
Tách DNA của mẫu cà chua nghi nhiễm TYLCV sử dụng phƣơng pháp dùng CTAB với một số thay đổi cho phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm [12].
Các bƣớc tiến hành (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
(1) Nghiền 0.5g mẫu lá trong nitơ lỏng trong ống eppendorf 2 ml thành dạng bột mịn sau đó bố sung nhanh vào mỗi ống 600 µl dung dịch đệm tách (Bảng 2.1), đảo đều ủ ở 65 oC trong 1 giờ 45 phút.
(2) Thêm hỗn hợp cloroform : isoamylalcohol (24 : 1) với tỷ lệ tƣơng đƣơng về thể tích với mẫu, trộn đều 10 phút đến khi dung dịch màu sữa. Ly tâm 12000 vòng/phút trong 15 phút ở 4 oC, thu dịch pha trên chuyển sang ống eppendorf 1,5 ml vô trùng. (3)Thêm isopropannol với tỷ lệ tƣơng đƣơng về thể tích với mẫu, trộn nhẹ, để tủ lạnh -20oC khoảng 30 phút.
(4) Ly tâm 12000 vòng/phút trong 15 phút ở 4oC, loại bỏ dịch, úp ống eppendorf xuống giấy cho khô, thu tủa DNA sau đó rửa DNA bằng cồn 70o
.
(5) Rửa tủa DNA bằng cách bổ sung 300 µl cồn 70%, ly tâm 12000 vòng/phút trong 15 phút ở 4oC, loại bỏ cồn (bƣớc này lặp lại 2 lần)
(6) Làm khô DNA bằng cách để trong box bật quạt. (7) Hòa tan DNA trong 50 µl nƣớc khử ion, vô trùng
(8) Kiểm tra DNA tổng số bằng phƣơng pháp điện di hoặc đo quang phổ.
2.2.6.2. Phƣơng pháp điện di trên gel agarose
(1) Chuẩn bị gel agarose 0,8%: Hòa 0,8g agarose trong 100ml dung dịch đệm TAE 1X, đun sôi cho agarose tan hoàn toàn bằng lò vi sóng. Để nhiệt độ hạ xuống còn khoảng 50 – 60o C, đổ dung dịch agarose vào khuôn điện di đã gài sẵn răng lƣợc thích hợp. Sau 30 – 60 phút, khi gel đã đông, đặt gel vào hộp điện di. Đổ đệm TAE 1X ngập cách mặt gel 1 – 2 mm.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/
28
(2) Tra mẫu: trộn một lƣợng mẫu DNA thích hợp với khoảng 1,5 – 3 µl đệm tra mẫu (20% Glyxerol; 100 mM Tris – HCl, pH = 8,0; 10 mM EDTA, pH = 8; 0,25% Bromophenol blue). Tra vào các giếng nhỏ trên gel.
(3) Tiến hành điện di với dòng điện một chiều có hiệu điện thế 80 – 120 V với thời gian từ 20 – 30 phút. DNA di chuyển từ cực âm đến cực dƣơng, quan sát sự di chuyển bằng màu xanh của bromophenol blue.
(4) Nhuộm gel bằng EtBr: bản gel đƣợc lấy ra khỏi khuôn và ngâm vào dung dịch EtBr nồng độ 0,1 µl/ml trong 10 phút, sau đó rửa sạch gel bằng nƣớc.
(5) Quan sát và chụp ảnh: gel đƣợc quan sát dƣới ánh sáng tử ngoại có bƣớc sóng 254 nm trên máy soi DNA. Quan sát thấy DNA hiện lên dƣới dạng các vạch sáng. Ảnh điện di đƣợc chụp bằng máy chụp ảnh.
2.2.6.3. Phƣơng pháp PCR nhân gen của TYLCV
Để phân lập gen CP và vòng DNA-A của TYLCV, chúng tôi sử dụng cặp mồi đa dụng pRV 324N/pRC889N [37] và sử dụng thành phần của phản ứng PCR nhƣ bảng 2.2.
Bảng 2.2. Thành phần phản ứng PCR nhân gen TYLCV từ mẫu DNA tổng số
TT Thành phần Thể tích (µl ) 1 Nước cất khử ion, khử trùng 14 2 Buffer PCR (10X) 2 3 MgCl2 (25mM) 2 4 dNTPs(10mM) 1,6 5 Mồi xuôi(10pmol) 1 6 Mồi ngược(10pmol) 1 7 Taq-polymerase (5u/µl) 0,4 8 DNA tổng số(50ng/µl) 1 Tổng 25
Tiến hành phản ứng PCR nhân đoạn DNA thuộc vùng CP của TYLCV với chu trình nhiệt: 94o
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/
29
– 10 phút, 4o
C – 8 phút. Còn đối với chu trình nhiệt của phản ứng PCR nhân đoạn DNAβ vệ tinh là: 94o
C – 3 phút; [94oC – 1 phút, 52oC – 1 phút, 72oC – 1 phút 30 giây]30 chu kỳ; 72oC – 10 phút, 4oC – . Sản phẩm PCR đƣợc điện di trên gel agarose 0,8 %, nhuộm bản gel trong ethidium bromide. Sau đó soi và chụp ảnh dƣới ánh sáng đèn cực tím của máy soi gel.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/
30
Chƣơng 3 : KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1. Kết quả tạo nguồn bệnh
3.1.1. Kết quả lây nhiễm virus trong vƣờn có nguồn bệnh
Để tạo nguồn cây bệnh phục vụ thí nghiệm ghép áp và nuôi thả bọ phấn 3 lô thí nghiệm, mỗi lô trồng 25 cây trong chậu đặt tại vƣờn thí nghiệm với sự có mặt của quần thể bọ phấn đã sinh sống nhiều năm hiện đang sống cộng sinh với các cây cà chua nhiễm bệnh xoăn vàng lá ở mức 3, 4. Sau 30 ngày, chúng tôi thu đƣợc 63 dòng có các triệu nhiễm TYLCV (Bảng 3.1). (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
3.1 áp lực bệnh cao
Lô Thí
nghiệm Số cây trồng nhiễm bệnh Cây không Mức 1 Mức 2 Số cây nhiễm bệnh Mức 3 Mức 4
1 25 3 3 7 7 5
2 25 4 5 7 5 4
3 25 5 3 4 7 6
Hình 3.1: Hình cây cà chua bị bệnh xoăn vàng lá do virus TYLCV trồng tại vườn có nguồn bệnh sau 50 ngày
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/
31
. Sau 50 ngày theo dõi, cả 3 lô thí nghiệm đều có các cây nhiễm bệnh với mức độ khác nhau. Nhƣ vậy, chúng tôi đã tạo đƣợc dòng cây có biểu hiện mắc bệnh xoắn vàng lá do virus sau 50 ngày trồng trong điều kiện có áp lực bệnh. Để chắc chắn biểu hiện bệnh trên là do TYLCV, cần phải kiểm tra sự có mặt của virus trên cây bệnh.
3.1.2. Kết quả PCR kiểm tra sự có mặt của virus trên cây bệnh
Tách chiết DNA tổng số các mẫu lá cà chua
Trong tách chiết DNA tổng số từ thực vật, có nhiều phƣơng pháp khác nhau đã đƣợc ứng dụng, trong đó phƣơng pháp dùng CTAB có ƣu điểm là khá đơn giản, tiết kiệm thời gian mà DNA thu đƣợc vẫn đảm bảo chất lƣợng.
Để tách đƣợc DNA của TYLCV có chất lƣợng tốt và đáp ứng các mục đích thí nghiệm, chúng tôi sử dụng phƣơng pháp dùng CTAB với một số thay đổi cho phù hợp với điều kiện thí nghiệm ở Việt Nam. Phƣơng pháp này đơn giản, nhanh và đƣợc sử dụng phổ biến. Tuy nhiên, DNA của virus sẽ lẫn với DNA của cà chua, các protein chƣa bị loại bỏ hoàn toàn. Lá cá chua bị nhiễm bệnh đƣợc nghiền nhanh trong nitơ lỏng để tránh DNase
phân cắt. DNA đƣợc kết tủa bằng isopropanol và rửa bằng ethanol 70%. Độ tinh sạch của DNA đƣợc kiểm tra bằng cách đo quang phổ hấp thụ (OD) và điện di trên gel agarose 0,8%.
Trong quá trình tách chiết DNA tổng số, vấn đề cần quan tâm là thu nhận đƣợc các phân tử DNA ở trạng thái nguyên vẹn, không bị phân hủy bởi tác nhân cơ học (quá trình nghiền) hay tác nhân hóa học (các enzyme nội bào hoặc từ môi
Hình 3.2 Kết quả điện di sản phẩm tách DNA tổng số của một số dòng cà chua nhiễm bệnh
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/
32
trƣờng bên ngoài). Hiện nay, đã có nhiều cải tiến trong quy trình tách chiết DNA sử dụng CTAB tỏ ra đặc biệt hiệu quả trong đó với cả các mẫu mô thực vật chứa nhiều polysaccharid và polyphenol. Phƣơng pháp dùng CTAB để tách chiết DNA tổng số từ mẫu mô thực vật ngày nay đã đƣợc sử dụng phổ biến trong nhiều công trình nghiên cứu.
Kết quả điện di của chúng tôi cho thấy
dòng cà chua cho việc tiến hành .
Kiểm tra sự có mặt của TYLCV trên các cây bệnh bằng phản ứng PCR
Kết quả PCR cho phép nhân một đoạn DNA nằm giữa hai vùng trình tự DNA đã biết. Để xác định sự có mặt của virus trong các mẫu lá cây nhiễm bệnh, chúng tôi sử dụng cặp mồi đa dụng prV224N/prC889N để nhân bản vùng gen CP
mã hóa protein vỏ của TYLCV. Phản ứng PCR đƣợc tiến hành với 30 chu kỳ. Sản phẩm PCR đƣợc điện di trên gel agarose 0,8%, nhuộm trong EtBr và soi dƣới ánh sáng tia tử ngoại. Theo lý thuyết, khi sử dụng cặp mồi trên, sẽ nhân đƣợc đoạn gen CP có kích thƣớc khoảng 600 bp. Kết quả điện di sản phẩm PCR đƣợc thể hiện ở hình 3.2.
Hình 3.3 Kết quả PCR kiểm tra gen CP của TYLCV trong các mẫu cà chua nhiễm bệnh M. Marker 1kb; 1-12. Kết quả PCR nhân gen CP của TYLCV từ các cây cà chua bị bệnh
10
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/
33
. 3.2. Kết quả lây nhiễm TYLCV cho cà chua bằng bọ phấn (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
TYLCV không lây nhiễm qua các va chạm cơ học mà lây lan qua vật truyền trung gian là bọ phấn trắng. Thí nghiệm lây nhiễm virus TYLCV bằng bọ phấn đƣợc bố trí trong khoảng thời gian từ đầu tháng 9 năm 2013 đến cuối tháng 4 năm 2014, đây là thời điểm có nhiệt độ và thời gian thích hợp cho sự sinh trƣởng và phát triển của cà chua và bọ phấn (Bemisia tabaci)ở điều kiện khí hậu miền Bắc Việt Nam.
Trong vƣờn thí nghiệm gần nguồn bọ phấn chúng tôi tiến hành bố trí các lồng thí nghiệm, lồng có khung sắt và đƣợc bao quanh bằng lƣới chống côn trùng. Trong mỗi lồng để một cây bị bệnh xoăn vàng lá do TYLCV ở mức độ 3 hoặc 4 và 5 cây thí nghiệm. Tiến hành bắt thả 10 - 15 cá thể bọ phấn vào lồng thí nghiệm nuôi trong 48 giờ. Sau đó dùng bình xịt thuốc diệt côn trùng để diệt bọ phấn. Mỗi thí nghiệm tiến hành nuôi thả bọ phấn 3 lần, mỗi lần cách nhau 10 ngày. Biểu hiện bệnh đƣợc theo dõi trong 50 ngày.
Bảng 3.2 tổng hợp về mức độ biểu hiện bệnh và thời gian chuyển bệnh trung bình của các giống cà chua PT18, GM2008, DV2962, sau lây nhiễm bằng bọ phấn. So sánh mức độ biểu hiện bệnh và thời gian chuyển bệnh trên các giống cà chua lây nhiễm TYLCV cho thấy mức độ biểu hiện bệnh và thời gian chuyển bệnh ở các giống cà chua không đồng đều. Ở giống PT18, sau 3 lần nuôi thả bọ phấn thu đƣợc 12/15 cây bị nhiễm bệnh chiếm tỉ lệ 80% (Phụ lục 1). Bệnh biểu hiện chủ yếu ở mức độ 1 và 2, một số cây biểu hiện không rõ hoặc không thấy biểu hiện bị bệnh. Bên cạnh đó, thời gian chuyển bệnh chậm, trung bình sau lây nhiễm 20 đến 25
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/
34
ngày mới thấy có biểu hiện bệnh trên cây, mức độ biểu hiện bệnh trên các cây không rõ và sau 50 ngày mức biểu hiện bệnh trung bình là 1,93 ± 0,28 ( Bảng 3.2)
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/
35
Bảng 3.2.Mức độ biểu hiện bệnh của các giống cà chua sau lây nhiễm TYLCV thông qua bọ phấn
Giống
Mức độ biểu hiện bệnh của các giống cà chua sau lây nhiễm TYLCV (Ngày theo dõi)
20 25 30 35 40 45 50 PT18 0,00 0,33 ± 0,12 0,66 ± 0,12 0,80 ± 0.14 1,20 ± 0,20 1,60 ± 0,20 1,93 ± 0,28 GM2008 0,00 0,00 0,50 ± 0,14 0,50 ± 0,14 0,90 ± 0,17 1,10 ± 0,22 1,40 ± 0,27 DV2962 0,00 0,10 ± 0,09 0,40 ± 0,13 0,50 ± 0,14 0,70 ± 0,17 0.90 ± 0,21 1,20 ± 0,27 TB 0,00 0,10 ± 0,05 0,50 ± 0,05 0,60 ± 0,20 0,90 ± 0,14 1,20 ± 0,20 1.,0 ± 0,20
Ghi chú : Mỗi dòng thí nghiệm tiến hành với 5 cây, lặp lại thí nghiệm 3 lần biểu hiện bệnh được đánh giá theo mức độ từ 0 đến 4. Kết quả lấy giá trị trung bình của các lần theo dõi. TB : Trung
bình
Kết quả lây nhiễm trên giống GM 2008 đạt 11/15 cây biểu hiện bệnh sau 50 ngày lây nhiễm chiếm tỉ lệ là 73,3%. Tƣơng tự nhƣ biểu hiện bệnh ở giống PT18, mức độ biểu hiện bệnh trên các cây không rõ ràng, chủ yếu ở mức độ 1 và 2 một số cây biểu hiện không rõ hoặc không thấy biểu hiện bị bệnh (Phụ lục 2). Kết quả cũng cho thấy thời gian chuyển bệnh chậm, trung bình sau lây nhiễm 30 - 35 ngày mới xuât hiện bệnh trên cây, mức độ biểu hiện bệnh trên các cây không rõ, sau 50 ngày mức bệnh trung bình là 1,40 ± 0,27.
Đối với cà chua DV2962, đây là giống đƣợc lai tạo và chọn lọc theo hƣớng kháng với virus TYLCV. Sau 50 ngày lây nhiễm TYLCV bằng bọ phấn thu đƣợc 9/ 15 cây thí nghiệm có biểu hiện bệnh xoăn vàng lá do TYLCV tỉ lệ 60% (Phụ lục 3). Tuy nhiên thời gian chuyển bệnh chậm, trung bình sau lây nhiễm 25 - 30 ngày mới có biểu hiện bệnh, mức độ biểu hiện bệnh trên các cây không rõ, chủ yếu ở mức độ 1. Sau 50 ngày mức nhiễm bệnh trung bình thu đƣợc là 1,20 ± 0,27.
So với các công bố trƣớc sau 20 ngày lây nhiễm bằng bọ phấn triệu chứng