3. Nội dung nghiên cứu
3.4. Kết quả lây nhiễmTYLCV bằng Agro-inoculation
Một ngày trƣớc khi lây nhiễm, tiến hành nuôi lắc khuẩn lạc của các chủng khuẩn C58/PC2300/TY và C58/PC2300/β riêng biệt trên môi trƣờng LB lỏng có bổ sung kháng sinh rifamycin (25 mg/l) và kanamycin (50 mg/l) ở 28 oC, lắc 200 vòng/phút. Sau 16 – 18 giờ, thực hiện đo OD của các chủng khuẩn trƣớc khi ly tâm để thu cặn khuẩn và hòa vào dung dịch lây nhiễm. Bảng 3.4 thể hiện kết quả OD660 của cả ba lần nuôi khuẩn chuẩn bị cho các đợt lây nhiễm vào cây cà chua.
Bảng 3.4. Giá trị OD ở bước sóng 660 nm của các chủng khuẩn sau nuôi lắc
Chủng khuẩn Lây nhiễm lần 1 Lây nhiễm lần 2 Lây nhiễm lần 3 C58/PC2300/TY 0,50 0,65 0,67
C58/PC2300/β 0,55 0,71 0,64
Các giá trị OD660 của các chủng khuẩn C58/PC2300/TY và C58/PC2300/β thu đƣợc sau nuôi lắc trên môi trƣờng LB lỏng bổ sung kháng sinh để chuẩn bị cho các đợt tiêm khuẩn vào cây cà chua đều có giá trị trong khoảng 0,5 – 1. Điều này chứng tỏ sự tăng sinh của các chủng khuẩn mang vector tái tổ hợp đảm bảo về mặt
Hình 3.5 Kết quả PCR nhân gen CP của TYLCV kiểm tra sự có mặt của virus trong các dòng cây thí nghiệm sau lây nhiễm
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/
40
số lƣợng và chất lƣợng để thực hiện các thí nghiệm tiếp theo nhằm lây nhiễm TYLCV vào cây cà chua.
Trƣớc khi lây nhiễm, dịch khuẩn đƣợc ly tâm riêng rẽ các chủng vi khuẩn này ở tốc độ 3000 vòng/phút, trong 6 phút, ở 4oC để thu cặn, sau đó hòa tan ra dung dịch lây nhiễm (MgCl2 10 mM, MES 10 mM, AS 100 µM) với thể tích tƣơng đƣơng. Cuối cùng, để hỗn hợp dịch khuẩn ở nhiệt độ phòng khoảng 1 – 2 giờ rồi tiến hành tiêm cho cây.
Tiến hành tiêm cho mỗi cây khoảng 0,5 ml dịch chứa vi khuẩn bằng xi lanh y tế không có kim tiêm mà thông qua áp lực đẩy dịch khuẩn vào mặt dƣới các lá thứ 2, 3 từ trên xuống của cây thí nghiệm. Thực hiện lây nhiễm lần 1 khi cây cà chua đạt chiều cao từ 10 – 15 cm. Thí nghiệm đƣợc lặp lại 3 lần cách nhau 10 ngày. Theo dõi và đánh giá biểu hiện bệnh do TYLCV gây ra theo tiêu chí của Lapidot và Friedmann đƣa ra năm 2002 [26]. Kết quả sau theo dõi biểu hiện bệnh sau 50 ngày lây nhiễm thông qua Agro- inoculation thể hiện trong bảng 3.5.
Bảng 3.5. Kết quả theo dõi biểu hiện bệnh sau lây nhiễm TYLCV bằng Agro- inoculation vào các giống cà chua
Giống
Mức độ biểu hiện bệnh của các giống cà chua sau lây nhiễm TYLCV (Ngày theo dõi)
25 30 35 40 45 50
PT18 0,00 0,20 ± 0,11 0,60 ± 0,13 0,73 ± 0,12 0,80 ± 0,14 1,07 ± 0,21
GM2008 0,00 0,07 ± 0,07 0,33 ± 0,13 0,53 ± 0,13 0,60 ± 0,13 0,73 ± 0,18
DV2962 0,00 0,07 ± 0,07 0,20 ± 0,11 0,40 ± 0,13 0,53 ± 0,13 0,67 ± 0,16
TB 0,00 0,11 ± 0,04 0,38 ± 0,12 0,55 ± 0,10 0,64 ± 0,08 0,82 ± 0,12
Ghi chú : Mỗi dòng thí nghiệm tiến hành ghép 5 cây, lặp lại thí nghiệm 3 lần biểu hiện bệnh được đánh giá theo mức độ từ 0 đến 4. Kết quả lấy giá trị trung bình của các lần theo dõi. TB : Trung bình
Kết quả từ bảng 3.5 cho thấy, sau 3 lần lây nhiễm chủng khuẩn mang vector tái tổ hợp chứa genome TYLCV thu đƣợc một số dòng biểu hiện bệnh
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/
41
TYLCV. Bệnh bắt đầu biểu hiện sau 30 ngày lây nhiễm. Tuy nhiên, sự biểu hiện bệnh rất nhẹ và dƣờng nhƣ không có sự chuyển biến. Đến ngày thứ 50 biểu hiện cây bệnh vẫn chỉ ở cấp độ 1 (0,82 ± 0,12) rất khó phân biệt với cây bình thƣờng, cây bệnh chỉ có biểu hiện vàng nhẹ ở mép lá. Để xác định chính xác hơn khả năng lây nhiễm TYLCV vào cây thông qua phƣơng pháp này, chúng tôi đã sử dụng kỹ thuật PCR để kiểm tra sự có mặt của TYLCV thông qua việc sử dụng cặp mồi đa dụng để nhân đoạn DNA thuộc vùng gen CP của TYLCV.
Kiểm tra cây sau lây nhiễm bằng phản ứng PCR
Tiến hành thu lá các cây nhiễm bệnh sau lây nhiễm 10 và 50 ngày, tách DNA tổng số. Sau khi thu đƣợc DNA tổng số đảm bảo tiêu chuẩn cần thiết, chúng tôi tiến hành nhân đoạn DNA thuộc vùng CP của TYLCV bằng PCR với cặp mồi prV324N/prC889N từ DNA tổng số của các cây thí nghiệm.
Hình 3.6 Ảnh điện di sản phẩm PCR kiểm tra TYLCV sau 10 ngày lây nhiễm bằng Agro -
inoculation
600bp
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/
42
Kết quả điện di trên hình 3.8. cho thấy, sau 10 ngày lây nhiễm, chỉ có
C58/PC2300/TY – mẫu đối chứng dƣơng (kí hiệu trên hình là C58) là cho băng vạch DNA tập trung sáng gọn và rõ nét, có kích thƣớc khoảng 600 bp phù hợp với kích thƣớc nhân đoạn mong muốn với cặp mồi prV324N/prC889N. Vì vậy, có thể kết luận rằng sau 10 ngày lây nhiễm vi khuẩn mang vector tái tổ hợp, virus chƣa xuất hiện ở các lá mới.
Sau 50 ngày lây nhiễm bằng Agro-inoculation, kiểm tra sự có mặt của TYLCV ở các cây cà chua thu đƣợc kết quả các mẫu M2, M5, M7và M9 là cho băng vạch DNA tập trung sáng gọn và rõ nét, có kích thƣớc khoảng 600 bp phù hợp với kích thƣớc nhân đoạn mong muốn với cặp mồi đặc hiệu prV324N/prC889N. Vì vậy, có thể kết luận rằng lây nhiễm virus TYLCV bằng
Agro - inoculation đã thành công. Tuy nhiên, sự biểu hiện bệnh TYLCV ở các thí nghiệm chỉ ở mức độ nhẹ. Từ kết quả trên có thể kết luận rằng, phƣơng pháp lây nhiễm bằng Agro - inoculation có thể áp dụng để lây nhiễm TYLCV vào cà chua. Hơn nữa, phƣơng pháp này phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm sinh học phân tử ở nhiều nơi, và không phụ thuộc vào điều kiện môi trƣờng nhƣ các phƣơng pháp lây nhiễmTYLCV khác nhƣ phƣơng pháp ghép áp giữa cây lành và cây đã bị bệnh, phƣơng pháp lây truyền TYLCV qua bọ phấn trắng. Tuy nhiên, ứng dụng kỹ thuật này để đánh giá khả năng kháng của cây cà chua đối với TYLCV là rất khó bởi biểu hiện bệnh không rõ ràng và rất khó nhận biết.