3. Nội dung nghiên cứu
2.2.6.3. Phƣơng pháp PCR nhân gen của TYLCV
Để phân lập gen CP và vòng DNA-A của TYLCV, chúng tôi sử dụng cặp mồi đa dụng pRV 324N/pRC889N [37] và sử dụng thành phần của phản ứng PCR nhƣ bảng 2.2.
Bảng 2.2. Thành phần phản ứng PCR nhân gen TYLCV từ mẫu DNA tổng số
TT Thành phần Thể tích (µl ) 1 Nước cất khử ion, khử trùng 14 2 Buffer PCR (10X) 2 3 MgCl2 (25mM) 2 4 dNTPs(10mM) 1,6 5 Mồi xuôi(10pmol) 1 6 Mồi ngược(10pmol) 1 7 Taq-polymerase (5u/µl) 0,4 8 DNA tổng số(50ng/µl) 1 Tổng 25
Tiến hành phản ứng PCR nhân đoạn DNA thuộc vùng CP của TYLCV với chu trình nhiệt: 94o
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/
29
– 10 phút, 4o
C – 8 phút. Còn đối với chu trình nhiệt của phản ứng PCR nhân đoạn DNAβ vệ tinh là: 94o
C – 3 phút; [94oC – 1 phút, 52oC – 1 phút, 72oC – 1 phút 30 giây]30 chu kỳ; 72oC – 10 phút, 4oC – . Sản phẩm PCR đƣợc điện di trên gel agarose 0,8 %, nhuộm bản gel trong ethidium bromide. Sau đó soi và chụp ảnh dƣới ánh sáng đèn cực tím của máy soi gel.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/
30
Chƣơng 3 : KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1. Kết quả tạo nguồn bệnh
3.1.1. Kết quả lây nhiễm virus trong vƣờn có nguồn bệnh
Để tạo nguồn cây bệnh phục vụ thí nghiệm ghép áp và nuôi thả bọ phấn 3 lô thí nghiệm, mỗi lô trồng 25 cây trong chậu đặt tại vƣờn thí nghiệm với sự có mặt của quần thể bọ phấn đã sinh sống nhiều năm hiện đang sống cộng sinh với các cây cà chua nhiễm bệnh xoăn vàng lá ở mức 3, 4. Sau 30 ngày, chúng tôi thu đƣợc 63 dòng có các triệu nhiễm TYLCV (Bảng 3.1).
3.1 áp lực bệnh cao
Lô Thí
nghiệm Số cây trồng nhiễm bệnh Cây không Mức 1 Mức 2 Số cây nhiễm bệnh Mức 3 Mức 4
1 25 3 3 7 7 5
2 25 4 5 7 5 4
3 25 5 3 4 7 6
Hình 3.1: Hình cây cà chua bị bệnh xoăn vàng lá do virus TYLCV trồng tại vườn có nguồn bệnh sau 50 ngày
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/
31
. Sau 50 ngày theo dõi, cả 3 lô thí nghiệm đều có các cây nhiễm bệnh với mức độ khác nhau. Nhƣ vậy, chúng tôi đã tạo đƣợc dòng cây có biểu hiện mắc bệnh xoắn vàng lá do virus sau 50 ngày trồng trong điều kiện có áp lực bệnh. Để chắc chắn biểu hiện bệnh trên là do TYLCV, cần phải kiểm tra sự có mặt của virus trên cây bệnh.
3.1.2. Kết quả PCR kiểm tra sự có mặt của virus trên cây bệnh
Tách chiết DNA tổng số các mẫu lá cà chua
Trong tách chiết DNA tổng số từ thực vật, có nhiều phƣơng pháp khác nhau đã đƣợc ứng dụng, trong đó phƣơng pháp dùng CTAB có ƣu điểm là khá đơn giản, tiết kiệm thời gian mà DNA thu đƣợc vẫn đảm bảo chất lƣợng.
Để tách đƣợc DNA của TYLCV có chất lƣợng tốt và đáp ứng các mục đích thí nghiệm, chúng tôi sử dụng phƣơng pháp dùng CTAB với một số thay đổi cho phù hợp với điều kiện thí nghiệm ở Việt Nam. Phƣơng pháp này đơn giản, nhanh và đƣợc sử dụng phổ biến. Tuy nhiên, DNA của virus sẽ lẫn với DNA của cà chua, các protein chƣa bị loại bỏ hoàn toàn. Lá cá chua bị nhiễm bệnh đƣợc nghiền nhanh trong nitơ lỏng để tránh DNase
phân cắt. DNA đƣợc kết tủa bằng isopropanol và rửa bằng ethanol 70%. Độ tinh sạch của DNA đƣợc kiểm tra bằng cách đo quang phổ hấp thụ (OD) và điện di trên gel agarose 0,8%.
Trong quá trình tách chiết DNA tổng số, vấn đề cần quan tâm là thu nhận đƣợc các phân tử DNA ở trạng thái nguyên vẹn, không bị phân hủy bởi tác nhân cơ học (quá trình nghiền) hay tác nhân hóa học (các enzyme nội bào hoặc từ môi
Hình 3.2 Kết quả điện di sản phẩm tách DNA tổng số của một số dòng cà chua nhiễm bệnh
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/
32
trƣờng bên ngoài). Hiện nay, đã có nhiều cải tiến trong quy trình tách chiết DNA sử dụng CTAB tỏ ra đặc biệt hiệu quả trong đó với cả các mẫu mô thực vật chứa nhiều polysaccharid và polyphenol. Phƣơng pháp dùng CTAB để tách chiết DNA tổng số từ mẫu mô thực vật ngày nay đã đƣợc sử dụng phổ biến trong nhiều công trình nghiên cứu.
Kết quả điện di của chúng tôi cho thấy
dòng cà chua cho việc tiến hành .
Kiểm tra sự có mặt của TYLCV trên các cây bệnh bằng phản ứng PCR
Kết quả PCR cho phép nhân một đoạn DNA nằm giữa hai vùng trình tự DNA đã biết. Để xác định sự có mặt của virus trong các mẫu lá cây nhiễm bệnh, chúng tôi sử dụng cặp mồi đa dụng prV224N/prC889N để nhân bản vùng gen CP
mã hóa protein vỏ của TYLCV. Phản ứng PCR đƣợc tiến hành với 30 chu kỳ. Sản phẩm PCR đƣợc điện di trên gel agarose 0,8%, nhuộm trong EtBr và soi dƣới ánh sáng tia tử ngoại. Theo lý thuyết, khi sử dụng cặp mồi trên, sẽ nhân đƣợc đoạn gen CP có kích thƣớc khoảng 600 bp. Kết quả điện di sản phẩm PCR đƣợc thể hiện ở hình 3.2.
Hình 3.3 Kết quả PCR kiểm tra gen CP của TYLCV trong các mẫu cà chua nhiễm bệnh M. Marker 1kb; 1-12. Kết quả PCR nhân gen CP của TYLCV từ các cây cà chua bị bệnh
10
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/
33
. 3.2. Kết quả lây nhiễm TYLCV cho cà chua bằng bọ phấn
TYLCV không lây nhiễm qua các va chạm cơ học mà lây lan qua vật truyền trung gian là bọ phấn trắng. Thí nghiệm lây nhiễm virus TYLCV bằng bọ phấn đƣợc bố trí trong khoảng thời gian từ đầu tháng 9 năm 2013 đến cuối tháng 4 năm 2014, đây là thời điểm có nhiệt độ và thời gian thích hợp cho sự sinh trƣởng và phát triển của cà chua và bọ phấn (Bemisia tabaci)ở điều kiện khí hậu miền Bắc Việt Nam.
Trong vƣờn thí nghiệm gần nguồn bọ phấn chúng tôi tiến hành bố trí các lồng thí nghiệm, lồng có khung sắt và đƣợc bao quanh bằng lƣới chống côn trùng. Trong mỗi lồng để một cây bị bệnh xoăn vàng lá do TYLCV ở mức độ 3 hoặc 4 và 5 cây thí nghiệm. Tiến hành bắt thả 10 - 15 cá thể bọ phấn vào lồng thí nghiệm nuôi trong 48 giờ. Sau đó dùng bình xịt thuốc diệt côn trùng để diệt bọ phấn. Mỗi thí nghiệm tiến hành nuôi thả bọ phấn 3 lần, mỗi lần cách nhau 10 ngày. Biểu hiện bệnh đƣợc theo dõi trong 50 ngày.
Bảng 3.2 tổng hợp về mức độ biểu hiện bệnh và thời gian chuyển bệnh trung bình của các giống cà chua PT18, GM2008, DV2962, sau lây nhiễm bằng bọ phấn. So sánh mức độ biểu hiện bệnh và thời gian chuyển bệnh trên các giống cà chua lây nhiễm TYLCV cho thấy mức độ biểu hiện bệnh và thời gian chuyển bệnh ở các giống cà chua không đồng đều. Ở giống PT18, sau 3 lần nuôi thả bọ phấn thu đƣợc 12/15 cây bị nhiễm bệnh chiếm tỉ lệ 80% (Phụ lục 1). Bệnh biểu hiện chủ yếu ở mức độ 1 và 2, một số cây biểu hiện không rõ hoặc không thấy biểu hiện bị bệnh. Bên cạnh đó, thời gian chuyển bệnh chậm, trung bình sau lây nhiễm 20 đến 25
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/
34
ngày mới thấy có biểu hiện bệnh trên cây, mức độ biểu hiện bệnh trên các cây không rõ và sau 50 ngày mức biểu hiện bệnh trung bình là 1,93 ± 0,28 ( Bảng 3.2)
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/
35
Bảng 3.2.Mức độ biểu hiện bệnh của các giống cà chua sau lây nhiễm TYLCV thông qua bọ phấn
Giống
Mức độ biểu hiện bệnh của các giống cà chua sau lây nhiễm TYLCV (Ngày theo dõi)
20 25 30 35 40 45 50 PT18 0,00 0,33 ± 0,12 0,66 ± 0,12 0,80 ± 0.14 1,20 ± 0,20 1,60 ± 0,20 1,93 ± 0,28 GM2008 0,00 0,00 0,50 ± 0,14 0,50 ± 0,14 0,90 ± 0,17 1,10 ± 0,22 1,40 ± 0,27 DV2962 0,00 0,10 ± 0,09 0,40 ± 0,13 0,50 ± 0,14 0,70 ± 0,17 0.90 ± 0,21 1,20 ± 0,27 TB 0,00 0,10 ± 0,05 0,50 ± 0,05 0,60 ± 0,20 0,90 ± 0,14 1,20 ± 0,20 1.,0 ± 0,20
Ghi chú : Mỗi dòng thí nghiệm tiến hành với 5 cây, lặp lại thí nghiệm 3 lần biểu hiện bệnh được đánh giá theo mức độ từ 0 đến 4. Kết quả lấy giá trị trung bình của các lần theo dõi. TB : Trung
bình
Kết quả lây nhiễm trên giống GM 2008 đạt 11/15 cây biểu hiện bệnh sau 50 ngày lây nhiễm chiếm tỉ lệ là 73,3%. Tƣơng tự nhƣ biểu hiện bệnh ở giống PT18, mức độ biểu hiện bệnh trên các cây không rõ ràng, chủ yếu ở mức độ 1 và 2 một số cây biểu hiện không rõ hoặc không thấy biểu hiện bị bệnh (Phụ lục 2). Kết quả cũng cho thấy thời gian chuyển bệnh chậm, trung bình sau lây nhiễm 30 - 35 ngày mới xuât hiện bệnh trên cây, mức độ biểu hiện bệnh trên các cây không rõ, sau 50 ngày mức bệnh trung bình là 1,40 ± 0,27.
Đối với cà chua DV2962, đây là giống đƣợc lai tạo và chọn lọc theo hƣớng kháng với virus TYLCV. Sau 50 ngày lây nhiễm TYLCV bằng bọ phấn thu đƣợc 9/ 15 cây thí nghiệm có biểu hiện bệnh xoăn vàng lá do TYLCV tỉ lệ 60% (Phụ lục 3). Tuy nhiên thời gian chuyển bệnh chậm, trung bình sau lây nhiễm 25 - 30 ngày mới có biểu hiện bệnh, mức độ biểu hiện bệnh trên các cây không rõ, chủ yếu ở mức độ 1. Sau 50 ngày mức nhiễm bệnh trung bình thu đƣợc là 1,20 ± 0,27.
So với các công bố trƣớc sau 20 ngày lây nhiễm bằng bọ phấn triệu chứng bệnhmới bắt đầu biểu hiện ở một số dòng[38], có thể tạm thời kết luận có thể sử
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/
36
dụng bọ phấn để lây nhiễm TYLCV cho cà chua, tuy nhiên phƣơng pháp này phụ thuộc rất nhiều vào mùa vụ, số lƣợng quần thể bọ phấn và nguồn bệnh. Biểu hiện bệnh không cao nhƣ mong đợi.
Kết quả kiểm tra cây sau nuôi thả bọ phấn bằng phản ứng PCR
Tiến hành thu lá các cây nhiễm bệnh sau ghép 50 ngày, tách DNA tổng số và , Kết quả điện di (hình 3.5) cho thấy, một số 1, 5,8,11, 13 . Điều đó chứng tỏ virus TYLCV đã
đƣợc truyền từ cây bệnh sang cây lành thông qua bọ phấn.
lây nhiễm bằng bọ phấn chúng tôi sử dụng trong thí nghiệm có thể áp dụng để lây nhiễm TYLCV vì đơn giản, dễ thực hiện, có thể thực hiện trong phòng thí nghiệm, nhà lƣới hay vƣờn thí nghiệm với số lƣợng cây nhiều mà kết quả đạt đƣợc vẫn đảm bảo độ tin cậy cho phép.
3.3. Kết quả lây nhiễm TYLCV bằng phƣơng pháp ghép cây lành với cây bị bệnh bệnh
Hình 3.4 Kết quả PCR nhân gen CP của TYLCV kiểm tra sự có mặt của virus trong các dòng cây thí
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/
37
TYLCV không lây truyền cơ học hay các va chạm bên ngoài mà chỉ truyền thông qua bọ phấn. Tuy nhiên trong tế bào cây bệnh, các virus này lại di chuyển rất nhanh. Chính vì vậy, chúng tôi tiến hành phƣơng pháp ghép áp cây lành và cây đã bị bệnh để virus truyền qua các gian bào của tế bào từ cây bệnh sang cây lành.
Chúng tôi tiến hành ghép các cây cà chua sạch virus đã đƣợc các li bằng lƣới chống côn trùng từ khi gieo hạt để kiểm tra mức độ lây lan virus. Tiến hành 3 lô thí nghiệm khác nhau trên 3 giống cà chua PT18; GM2008; DV2962 theo các bƣớc trình bày ở mục 2.2.2. Sau 50 ngày ghép chúng tôi thu đƣợc kết quả thể hiện trên bảng 3.3.
Bảng 3.3. Kết quả biểu hiện bệnh của các giống cà chua sau lây nhiễm bằng ghép áp
Giống
Mức độ biểu hiện bệnh của các giống cà chua sau lây nhiễm TYLCV (Ngày theo dõi)
10 15 20 25 30 35 40 45 50 PT18 0,0 0,33 ± 0,12 0,73 ± 0,15 1,13 ± 0,13 1,60 ± 0,13 2,13 ± 0,13 2,60 ± 0,13 3,00 ± 0,13 3,53 ± 0,13 GM2008 0,0 0,00 0,13 ± 0,09 0,53 ± 0,13 0,87 ± 0,16 1,00 ± 0,19 1,53 ± 0,21 1,93 ± 0,20 2,27 ± 0,24 DV2962 0,0 0,00 0,20 ± 0,10 0,53 ± 0,13 0,80 ± 0,10 0,93 ± 0,15 1,40 ± 0,19 1,80 ± 0,26 2,13 ± 0,27 TB 0,0 0,00 0,35 ± 0,18 0,73 ± 0,19 1,08 ± 0,25 1,35 ± 0,38 1,84 ± 0,37 2,24 ± 0,37 2,64 ± 0,44
Ghi chú : Mỗi dòng thí nghiệm tiến hành ghép 5 cây, lặp lại thí nghiệm 3 lần biểu hiện bệnh được đánh giá theo mức độ từ 0 đến 4. Kết quả lấy giá trị trung bình của các lần theo dõi. TB : Trung bình
Bảng 3.3 trình bày kết quả sau 50 ngày lây nhiễm bằng ghép áp. Từ kết quả bảng trên chúng tôi nhận thấy thời gian chuyển bệnh ở giống PT18 nhanh, trung bình sau lây nhiễm 15 đến 20 ngày đã có biểu hiện bệnh trên cây, mức độ biểu hiện bệnh trên các cây rõ, trung bình ở mức độ 3 sau ghép 50 ngày (3,53 ± 0,13). Tỉ lệ cây bị bệnh sau 50 ngày lây nhiễm là rất cao, 100% cây đều có biểu hiện bệnh (Phụ lục 4).
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/
38
Đối với giống GM 2008 (giống đƣợc lai tạo và chọn lọc theo hƣớng kháng với virus TYLCV), có thể thấy thời gian nhiễm bệnh trung bình cũng tƣơng đối nhanh, khoảng 20 đến 25 ngày sau lây nhiễm. Mức độ biểu hiện bệnh trên các cây tƣơng đối rõ, trung bình đạt 2,27 ± 0,24 sau 50 ngày ghép, một số biểu hiện ở mức 4. Tỉ lệ cây nhiễm bệnh sau 50 ngày lây nhiễm là rất cao 93,3% (Phụ lục 5).
Tƣơng tự, đối với thí nghiệm ghép áp trên cà chua DV2962 nhận thấy, sau 20 đến 25 ngày đã có biểu hiện nhiễm bệnh trên các cây thí nghiệm, mức độ biểu hiện bệnh trên các cây tƣơng đối rõ, trung bình ở mức độ 2 sau ghép 50 ngày, một số biểu hiện ở mức 3. Tỉ lệ cây nhiễm bệnh sau 50 ngày lây nhiễm cao đạt 86,7% (Phụ lục 6) và độ nhiễm bệnh trung bình là 2,13 ± 0,17.
Nhƣ vậy có thể thấy rằng việc lây nhiễm TYLCV thông qua ghép áp đạt kết quả rất khả quan. Tuy nhiên để chắc chắn biểu hiện bệnh trên là do virus TYLCV chúng tôi sử dụng phƣơng pháp phân tử PCR để nhân gen kiểm tra sự có mặt của TYLCV trong cây thí nghiệm.
Kết quả kiểm tra cây sau ghép bằng phản ứng PCR
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/
39
Kết quả điện di (hình 3.6
1
. Điều đó chứng tỏ virus đã đƣợc truyền từ cây bệnh sang cây lành thông qua vết ghép.
chúng tôi sử dụng trong thí nghiệm có thể áp dụng tốt để lây nhiễm TYLCV vì đơn giản, dễ thực hiện, có thể thực hiện trong phòng thí nghiệm, nhà lƣới hay vƣờn thí nghiệm với số lƣợng cây nhiều mà kết quả đạt đƣợc vẫn đảm bảo độ tin cậy cho phép.
3.4. Kết quả lây nhiễm TYLCV bằng Agro - inoculation
Một ngày trƣớc khi lây nhiễm, tiến hành nuôi lắc khuẩn lạc của các chủng khuẩn C58/PC2300/TY và C58/PC2300/β riêng biệt trên môi trƣờng LB lỏng có bổ sung kháng sinh rifamycin (25 mg/l) và kanamycin (50 mg/l) ở 28 oC, lắc 200 vòng/phút. Sau 16 – 18 giờ, thực hiện đo OD của các chủng khuẩn trƣớc khi ly tâm để thu cặn khuẩn và hòa vào dung dịch lây nhiễm. Bảng 3.4 thể hiện kết quả OD660 của cả ba lần nuôi khuẩn chuẩn bị cho các đợt lây nhiễm vào cây cà chua.
Bảng 3.4. Giá trị OD ở bước sóng 660 nm của các chủng khuẩn sau nuôi lắc
Chủng khuẩn Lây nhiễm lần 1 Lây nhiễm lần 2 Lây nhiễm lần 3