3. Nội dung nghiên cứu
1.3.Các phƣơng pháp lây nhiễmTYLCV trong thực nghiệm
Việc tìm hiểu về các con đƣờng truyền nhiễm virus thực vật trong tự nhiên và nhân tạo, có ý nghĩa rất quan trọng trong công tác chọn tạo giống cây trồng kháng lại mầm bệnh do virus thực vật gây ra. Đây là công việc thực sự có ý nghĩa trong khoa học và ứng dụng vào công tác chọn tạo giống cây trồng kháng lại virus và vector vật truyền trung gian.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/
18
Đối với TYLCV. Trong tự nhiên chỉ lây nhiễm từ cây này sang cây khác qua
Bemicia tabaci, do đó bằng cách sử dụng Bemicia tabaci làm vật truyền trung gian (vector truyền bệnh) để lây nhiễm nhân tạo TYLCV từ cây mang mầm bệnh sang cây lành trong vƣờn thí nghiệm, nhà lƣới hoặc đồng ruộng rồi thống kê kết quả và đánh giá khả năng kháng lại TYLCV của các giống cà chua tham gia khảo nghiệm, nhằm chọn tạo ra giống có khả năng kháng bệnh tốt nhất do loài virus này gây ra. Phƣơng pháp này đã đƣợc các nhà khoa học trên thế giới nghiên cứu và báo cáo vào năm 1960 [5], [8], [26].
Năm 2007, Inoue-Nagata
2 đến 4 tuần [21]. Hiện nay, phƣơng pháp lây nhiễm TYLCV thông qua bọ phấn để đánh giá khả năng kháng bệnh do virus này vẫn đƣợc sử dụng [16], [1], [38], [26]. Hiệu quả phƣơng pháp này là cao nhƣng phụ thuộc nhiều vào điều kiện sinh thái của bọ phấn. Mặt khác việc nuôi dƣỡng bọ phấn mang virus rất phức tạp và tốn nhiều công sức do bọ phấn có kích thƣớc rất nhỏ, vòng đời ngắn và sức sống yếu.
Trong quá trình nghiên cứu, ngƣời ta nhận thấy sau khi TYLCV đƣợc nhiễm vào cây cà chua thì sự lan truyền của chúng qua cầu nối sinh chất giữa các tế bào cạnh nhau trong mô cây là rất nhanh chóng. Do đó phƣơng pháp ghép áp cây lành với cây đã bị bệnh để gây nhiễm TYLCV đã đƣợc thử nghiệm và mang lại hiệu quả cao [32]. Phƣơng pháp này đƣợc tiến hành nhƣ sau: Tiến hành trồng các dòng cây cần lây nhiễm vào chậu thí nghiệm, tiến hành ghép sau khi cây đạt chiều cao khoảng 30 – 35 cm. Dùng dao lam cắt vát một miếng nhỏ (dài 1,5 – 2 cm, rộng 0,4 – 0,5 cm) vừa chạm vào lớp mạch gỗ của thân ở vị trí gần cành non của cây. Áp
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/
19
chỗ cắt của cây lành với cây bệnh, dùng băng dính buộc chặt lại, tạo điều kiện cho virus di chuyển từ cây bệnh sang cây lành. Dùng bình xịt phun sƣơng lên cây sau khi ghép, chụp lồng cách li côn trùng. Theo dõi biểu hiện bệnh trong 50 ngày. Phƣơng pháp này cho hiệu quả lan truyền rất cao [38].
Những năm gần đây, phƣơng pháp Agro - inoculation sử dụng để lây truyền virus thực vật nói chung và TYLCV nói riêng đã lây nhiễm thành công virus vào cây ký chủ [1], [2]. Phƣơng pháp Agro - inoculation sử dụng trong lây nhiễm TYLCV là phƣơng pháp mới nhất, sự tổng hợp đoạn DNA đầy đủ trình tự của genome virus đƣợc tái tổ hợp trong plasmid – T và đƣợc lây nhiễm thông qua vi khuẩn đất Agrobacteium tumefaciens truyền TYLCV vào cây cà chua, sau một thời gian sự biểu hiện triệu chứng bệnh do virus này gây ra xuất hiện, sử dụng các phƣơng pháp sinh học phân tử nhƣ PCR đặc hiệu đã xác định đƣợc sự có mặt của TYLCV trong cây bệnh với tần suất cao. Nhƣợc điểm của phƣơng pháp Agro- inoculation là biểu hiện bệnh thƣờng nhẹ, không rõ ràng và khó để phân loại mức độ biểu hiện bệnh dẫn đến kết quả đánh giá khả năng kháng bệnh cho cà chua khó chính xác.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/
20
Chƣơng 2 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu