Chuẩn bị thiết bị, dụng cụ: Nước biển đã qua túi siêu lọc và nước ngọt để vệ
sinh dụng cụ, cốc nhựa 500 ml để chứa trứng và tinh trùng, ca nhựa 2 lít, bình xịt nước. Kính hiển vi, dao tách vỏ hàu, ống hút, dao mổ y tế dùng để lấy trứng và tinh trùng, pipet, lưới, vợt rửa trứng,... Bếp, nồi để nấu nước biển và lượng nước đá cần thiết để duy trì nhiệt độ nước trong thí nghiệm sốc nhiệt.
Chuẩn bị hàu bố mẹ: Hàu bố mẹ nuơi vỗ tại đầm nuơi thương phẩm (đầm
Nha Phu, Ninh Hịa, Khánh Hịa) được kiểm tra độ thành thục trước khi mang về cho đẻ. Quá trình vận chuyển hàu bố mẹ từ điểm nuơi vỗ về trại thực nghiệm thực hiện bằng phương pháp vận chuyển khơ.
Chuẩn bị hĩa chất: Hĩa chất tạo tam bội gồm CB (Cytochalasin Binduced,
cĩ cơng thức là C29H37NO5) ở các nồng độ (0,1; 0,25; 0,5; 0,75 ppm) và hĩa chất DMSO (Dimethyl sulfoxide, cĩ cơng thức là (CH3)2SO).
2.2.3. Phương pháp thu trứng và tinh trùng
Hàu bố mẹ được vệ sinh sạch sẽ bằng bàn chải, sau đĩ được tách vỏ để kiểm tra giới tính và mức độ thành thục (trên kính hiển vi Optica). Cá thể được chọn cĩ tuyến sinh dục chín muồi, đặt riêng rẽ theo giới tính. Tinh trùng và trứng được tách riêng cẩn thận để tránh sự thụ tinh ngẫu nhiên bằng dao mổ và được chứa trong những cốc nhựa 250ml. Tất cả các cốc này được kiểm tra một lần nữa để đảm bảo tính riêng biệt của giới tính. Tất cả những cốc chứa trứng được nhập lại trong một ca nhựa 2 lít và rửa sạch (dùng lưới cỡ 20µm và 90µm). Tương tự như thế, tinh trùng của con đực cũng được nhĩm vào ca 1 lít.
2.2.4. Phương pháp xử lý tam bội
Xử lý bằng hĩa chất CB: Sau khi đếm trứng xong, cho tinh trùng vào để thụ tinh (trộn trứng và tinh trùng theo tỷ lệ thấp nhất là 1:1 để đảm bảo điều kiện thụ tinh tốt nhất). Từ đây, trứng được chia ra theo từng nghiệm thức thí nghiệm. Mật độ trứng khi xử lý hĩa chất khơng lớn hơn 50 triệu/lít nước. Theo dõi thời gian thụ tinh, sự hình thành thể cực thứ nhất dưới kính hiển vi. Khi xấp xỉ 50% trứng đã xuất hiện thể cực cầu thứ nhất, hĩa chất CB đã chuẩn bị sẵn được đưa vào trứng đã thụ tinh
bằng cách cho trực tiếp vào ca nhựa 2 lít chứa trứng đã thụ tinh. Sau 15 phút tiếp xúc với hĩa chất, trứng được rửa bằng nước biển và để lại vào cốc làm đầy đến thể tích 2 lít. Lúc này 2ml DMSO được thêm vào mỗi cốc 2 lít để giữ tế bào hoạt động bình thường sau tác dụng của CB. Sau 15 phút, trứng được rửa lại bằng nước biển và để lại vào cốc làm đầy đến thể tích 2 lít. Mỗi thí nghiệm với nồng độ độ hĩa chất CB khác nhau được đưa đi xác định tỷ lệ tạo tam bội, và cho vào bể 100 lít đã cấp nước sẵn để ấp trứng.
Xử lý bằng nhiệt độ: nghiệm thức tạo tam bơi bằng nhiệt độ được thực hiện riêng biệt bằng phương pháp sốc nhiệt và sốc lạnh.
Nghiệm thức sốc lạnh: Trứng thụ tinh được tiếp xúc một cách riêng biệt với
nước biển cĩ nhiệt độ thấp 5oC; 7oC và 9oC. Mỗi nghiệm thức được duy trì trong thời gian từ 10 phút. Các nghiệm thức được bắt đầu thực hiện sau khi trứng thụ tinh 20 phút. Để thực hiện sốc lạnh thì trứng sau khi thụ tinh được thu thập trong sàng lưới cĩ kích thước mắt lưới là 20 µm và cho vào thau nhựa 10 lít cĩ nước biển lọc sạch đã được duy trì ở nhiệt độ thấp (5oC; 7oC và 9oC). Quá trình tiến hành thí nghiệm ở nhiệt độ phịng (25oC) và thời gian tiến hành tương đối ngắn, do đĩ sự thay đổi nhiệt độ của lơ thí nghiệm khơng đáng kể.
Nghiệm thức sốc nĩng: Trứng thụ tinh được đưa vào sàng cĩ mắt lưới 20 µm,
sau đĩ xử lý nhiệt bằng cách ngâm vào trong nước biển lọc sạch đã được duy trì ở 35oC; 37oC và 39oCtrong 5 phút bằng cách thêm nước nĩng thường xuyên. Tất cả các nghiệm thức được bắt đầu thực hiên 20 phút sau khi thụ tinh. Thời gian thực hiện là 10 phút.