- Máy quang phổ UV – 1700 Shimadzu của Khoa Hóa học Trường Đại học Sư phạm – Đại học Thái Nguyên, có khả năng quét phổ trong khoảng bước sóng 190nm – 900 nm, có kết nối máy tính.
- Bộ cuvet thạch anh. - Cân điện tử có độ chính xác 0,0001g. - Bếp cách thủy. 2.2.2. Dụng cụ - Pipet các loại: 1mL, 2mL, 5mL, 10mL, 20mL, 25mL. - Bình định mức dung dịch: 10mL, 25mL, 50mL, 100mL, 500mL, 1000mL.
- Cốc thủy tinh, phễu thủy tinh, ống nghiệm...
- Chương trình lọc Kalman tính toán đồng thời nồng độ các cấu tử [12,23]. - Một số dụng cụ khác.
2.2.3. Hóa chất
- Dung dịch HCl, dung dịch HNO3, dung dịch H2SO4 ... đều thuộc loại tinh khiết của Merck.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
- Chất chuẩn paracetamol, cafein, phenylephin hydroclorit nguyên chất do viện kiểm nghiệm dược sản xuất.
- Thuốc viên panadol được sản xuất tại công ty cổ phần dược phẩm Sanofi - SynthelaboViệt Nam.
2.2.4. Chế phẩm Panadol cảm cúm
Mã sản phẩm: SDK: VD-2246-06
Thành Phần:
Mỗi viên nén chứa: Paracetamol : 500 mg Cafein : 25 mg
Phenylephin Hydroclorit: 5 mg
Chỉ định: Panadol cảm cúm làm giảm đau xoang và các triệu chứng
của cảm cúm như sốt, đau và xung huyết mũi.
2.3. Chuẩn bị các dung môi để hoà tan mẫu
Để hòa tan các mẫu nghiên cứu, chúng tôi đã sử dụng các dung môi sau: - Dung dịch HCl 10-1M; 10-2M; 10-3M.
- Dung dịch H2SO4 5.10-2M; 5.10-3M; 5. 10-4M. - Dung dịch HNO3 10-1M; 10-2M; 10-3M.
Lấy 41,8mL dung dịch HCl 37% (d = 1,18) pha loãng bằng nước cất 2 lần thành 500mL thu được dung dịch HCl 1M (pH = 0). Sau đó pha thành HCl 0,1M, HCl 0,01M và HCl 0,001M.
Lấy 5,5mL dung dịch H2SO4 97% (d = 1,84) pha loãng bằng nước cất 2 lần thành 100mL thu được dung dịch H2SO4 0,5M (pH = 0). Sau đó pha thành H2SO4 0,05M, H2SO4 0,005M và H2SO4 0,0005M.
Lấy 7mL dung dịch HNO3 65% (d = 1,39) pha loãng bằng nước cất 2 lần thành 100mL thu được dung dịch HNO3 1M (pH = 0). Sau đó pha thành HNO3 0,1M, HNO3 0,01M và HNO3 0,001M.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Các dung dịch này đều được xác định lại nồng độ bằng phương pháp chuẩn độ. (các dung dịch sau khi pha đều được kiểm tra và điều chỉnh bằng máy đo pH)
2.4. Đánh giá độ tin cậy của quy trình phân tích
2.4.1. Giới hạn phát hiện (LOD)
Giới hạn phát hiện được coi là nồng độ thấp nhất của chất nghiên cứu mà hệ thống phân tích cho tín hiệu phát hiện phân biệt với tín hiệu nền. Trong phân tích trắc quang LOD tính theo phương trình hồi quy có công thức như sau:
3.SD LOD =
B (2.1)
Trong đó:
SD: là độ lệch chuẩn của tín hiệu y trên đường chuẩn.
B: độ dốc của đường chuẩn chính là độ nhạy của phương pháp trắc quang.
2.4.2 . Giới hạn định lượng (LOQ)
Giới hạn định lượng được coi là nồng độ thấp nhất của chất nghiên cứu mà hệ thống phân tích định lượng được với tín hiệu phân tích khác, có ý nghĩa định lượng với tín hiệu nền và đạt độ tin cậy tối thiểu 95% thường người ta sử dụng công thức:
10.SD LOQ =
B (2.2)
2.4.3. Đánh giá độ tin cậy của phương pháp
- Đánh giá độ đúng của phương pháp đối với các hỗn hợp PRC , CFI và PNH tự pha chế thông qua sai số tương đối RE. Sai số tương đối của các phép phân tích đối với mẫu chuẩn tự pha chế thông qua việc tính tỷ số giữa độ sai lệch của nồng độ tính toán được với nồng độ thực đã biết của mẫu theo công thức:
Tinh toan 0 0 C - C RE% = .100% C (2.3) Trong đó:
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
RE% là sai số tương đối của phép xác định nồng độ các cấu tử. CTinh toan là nồng độ tính toán được từ chương trình lọc Kalman.
C 0(µg/mL) là nồng độ đã biết của dung dịch PRC, CFI và PNH trong hỗn hợp.
- Đánh giá độ đúng của phương pháp đối với các mẫu thuốc nghiên cứu thông qua độ thu hồi bằng phương pháp thêm chuẩn . Độ thu hồi (Rev) được tính theo công thức sau:
T a
C - C
Rev = .100%
a (2.4) Trong đó:
CT: nồng độ (µg/mL) của dung dịch PRC, CFI và PNH xác định được trong mẫu sau khi thêm chuẩn.
Ca: nồng độ (µg/mL) của dung dịch PRC, CFI và PNH xác định được trong mẫu khi chưa thêm chuẩn.
a: nồng độ (µg/mL) của dung dịch chuẩn PRC, CFI và PNH thêm vào mẫu (đã biết).
- Độ lặp lại của phương pháp được đánh giá thông qua độ lệch chuẩn (SD) hoặc độ lệch chuẩn tương đối (RSD).
n n 2 2 i i i=1 i=1 C - μ C - C SD = = k k (2.5) RSD S.100 = (%) C (2.6) Trong đó:
Ci là các giá trị nồng độ (µg/mL) của dung dịch PRC, CFI và PNH tính được lần thứ i.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
là giá trị nồng độ thực của mẫu.
C là giá trị nồng độ trung bình tính được sau n lần xác định. k là số bậc tự do.
2.4.4. Đánh giá kết quả phép phân tích theo thống kê
Khoảng tin cậy của phép xác định nồng độ được tính theo công thức: P,k
t .SD
C ± ε = C ±
n (2.7) Trong đó:
tP, k là hệ số phân bố chuẩn Student ứng với xác suất P và bậc tự do k được tra trong bảng.
C là giá trị trung bình của các giá trị nồng độ . SD: là độ lệch chuẩn được tính theo công thức (2.5). n : là số phép đo.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Chƣơng 3
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. Khảo sát phổ hấp thụ phân tử của paracetamol, cafein và phenylephin hydroclorit phenylephin hydroclorit
Để có thể xác định được paracetamol, cafein và phenylephin hydroclorit
bằng phương pháp trắc quang thì paracetamol, cafein và phenylephin hydroclorit phải hấp thụ quang trong khoảng bước sóng khảo sát. Vì vậy chúng tôi tiến hành khảo sát phổ hấp thụ phân tử và bước sóng cực đại của paracetamol, cafein và phenylephin hydroclorit.
Pha dung dịch P RC nồng độ 8 µg/mL, CFI nồng độ 8 µg/mL, PNH nồng độ 15 µg/mL trong HCl 0,1 M. Sau đó tiến hành quét phổ của các dung dịch đó trong khoảng bước sóng từ 200 đến 900 nm. Kết qu ả phổ hấp thụ quang phân tử của PRC, CFI và PNH ở bước sóng 210 - 285 nm được thể hiện ở hình 3.1.
Hình 3.1. Phổ hấp thụ quang của dung dịch chuẩn PRC(1), CFI(2) và PNH(3)
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Nhận xét: Từ kết quả thu được cho thấy PRC có độ hấp thụ quang cực đại tại λ = 244 nm, CFI có độ hấp thụ quang cực đại tại bước sóng λ = 272 nm còn PNH có độ hấp thụ quang cực đại tại λ = 273 nm. Phổ hấp thụ quang của PRC, CFI và PNH xen phủ nhau gần như hoàn toàn, gây khó khăn cho việc xác định đồng thời PRC, CFI và PNH trong hỗn hợp. Trên cơ sở khảo sát trong khoảng bước sóng 285 - 900 nm nhận thấy PRC, CFI và PNH gần như không hấp thụ ánh sáng. Mặt khác ở 200 – 210 nm thì giá trị lại rất lớn. Vì vậy, chúng tôi lựa chọn khoảng bước sóng để thực hiện các phép đo độ hấp thụ quang của dung dịch PRC, CFI và PNH trong khoảng 210 - 285 nm để tiến hành các nghiên cứu tiếp theo.
3.2. Khảo sát sự phụ thuộc độ hấp thụ quang của PRC, CFI và PNH vào pH
Pha chế 3 dãy dung dịch gồm 9 mẫu dung dị ch PRC có nồng độ 8 µg/mL, 9 mẫu dung dịch CFI và 9 mẫu dung dịch PN H có nồng độ 8 µg/mL trong các môi trường HCl, H2SO4, HNO3 có pH=1, pH=2, pH=3.
Sau đó chúng tôi tiến hành đo độ hấp thụ quang ở bước sóng cực đại của PRC là 244 nm, của CFI là 272 nm và của PN H là 273 nm ở nhiệt độ 250C. Bảng 3.1 là kết quả độ hấp thụ quang ở thời điểm 30 phút sau khi pha của PRC, CFI và PNH ở các giá trị pH.
Bảng 3.1. Độ hấp thụ quang của PRC, CFI và PNH ở các giá trị pH
Môi trường HCl HNO3 H2SO4
pH 1 2 3 1 2 3 1 2 3
A
PRC 0,521 0,519 0,510 0,518 0,511 0,497 0,520 0,535 0,501 CFI 0,396 0,394 0,391 0,369 0,367 0,360 0,409 0,403 0,400 PNH 0,070 0,069 0,063 0,074 0,073 0,062 0,065 0,066 0,065 Nhận xét: Từ kết quả thu được ở bảng 3.1 chúng tôi thấy rằng: Đối với PRC, CFI và PNH độ hấp thụ quang tương đối ổn định trong môi trường axit HCl. Tuy
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
nhiên, kết quả nghiên cứu sơ bộ cho thấy khoảng tuyến tính và độ tan cũng như độ hấp thụ quang của PRC, CFI và PNH đạt cực đại trong môi trường axit HCl 0,1M. Do đó, chúng tôi chọn môi trường để nghiên cứu thuận lợi cho cả PRC, CFI và PNH là dung dịch HCl 0,1M.
3.3. Khảo sát sự phụ thuộc độ hấp thụ quang của PRC, CFI và PNH theo thời gian thời gian
Để khảo sát xem thờ i gian có ảnh hưởng đến độ hấp thụ quang của PRC, CFI và PNH như thế nào chúng tôi tiến hành khảo sát độ hấp thụ quang của PRC, CFI và PNH trong khoảng thời gian 90 phút sau khi pha . Công việc khảo sát cụ thể như sau:
Pha dung dịch PRC, dung dịch CFI và dung dịch PNH trong HCl 0,1M có nồng độ 8µg/mL, đo độ hấp thụ quang của các dung dịch ở bước sóng 210 - 285nm; cứ 5 phút ta đo 1 lần. Độ hấp thụ quang trung bình (3 lần đo) ở bước sóng cực đại của PRC (244nm), CFI (272nm) và PNH (273nm) được trình bày ở bảng 3.2.
Bảng 3.2. Sự phụ thuộc độ hấp thụ quang của PRC, CFI và PNH theo thời gian
Thời gian (phút) 5 10 15 20 25 30 35 40 45 A PRC 0,524 0,524 0,523 0,522 0,521 0,521 0,521 0,521 0,521 CFI 0,394 0,395 0,395 0,395 0,396 0,396 0,396 0,396 0,396 PNH 0,071 0,071 0,071 0,071 0,070 0,070 0,070 0,070 0,070 Thời gian (phút) 50 55 60 65 70 75 80 85 90 A PRC 0,521 0,521 0,521 0,521 0,521 0,521 0,521 0,521 0,521 CFI 0,396 0,396 0,396 0,396 0,396 0,396 0,396 0,396 0,396 PNH 0,070 0,070 0,070 0,070 0,070 0,070 0,070 0,070 0,070
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Từ kết quả bảng 3.2 xây dựng được đường biểu diễn sự phụ thuộc của độ hấp thụ quang A theo thời gian có dạng như hình 3.3.
Hình 3.2. Sự phụ thuộc độ hấp thụ quang của PRC(1), CFI(2), PNH(3) theo thời gian
Nhận xét: Từ kết quả ở bảng 3.2 và hình 3.2 nhận thấy, trong khoảng
thời gian 90 phút sau khi pha, độ hấp thụ quang của các dung dịch PRC, CFI và PNH tương đối ổn định . Sự thay đổi chủ yếu ở khoảng thời gian 5 25 phút sau khi pha, sự thay đổi là không đáng kể. Như vậy, có thể nói các dung dịch PRC, CFI và PNH có độ hấp thụ quang ổn định trong khoảng thời gian từ 2590 phút sau khi pha. Các phép đo chúng tôi đều thực hiện từ 30 40 phút sau khi pha là thích hợp.
3.4. Khảo sát sự phụ thuộc độ hấp thụ quang của PRC, CFI và PNH theo nhiệt độ nhiệt độ
Để khảo sát sự thay đổi độ hấp thụ quang của PRC, CFI và PNH theo sự thay đổi của nhiệt độ chúng tôi ti ến hành pha các dung dịch chuẩn PRC, CFI và PNH có nồng độ 8µg/mL, trong HCl 0,1M. Sau đó đo độ hấp thụ quang của các dung dịch ở bước sóng 210 - 285nm, trong khoảng nhiệt độ khảo sát 25-500
C. Độ hấp thụ quang trung bình (3 lần đo ) ở bước sóng cực đại của PRC (244nm), CFI (272nm) và PNH (273nm) được trình bày ở bảng 3.3.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Bảng 3.3 Sự phụ thuộc độ hấp thụ quang của PRC, CFI và PNH theo nhiệt độ
Nhiệt độ (0 C) 25 30 35 40 45 50 A PRC(244nm) 0,519 0,521 0,521 0,523 0,522 0,525 CFI(727nm) 0,397 0,393 0,396 0,394 0,394 0,401 PNH(273nm) 0,070 0,070 0,070 0,071 0,069 0,071 Từ kết quả bảng 3.3. xây dựng đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc độ hấp thụ quang PRC, CFI và PNH theo nhiệt độ. Kết quả được thể hiện ở hình 3.3.
Hình 3.3. Sự phụ thuộc độ hấp thụ quang của PRC(1), CFI(2), PNH(3) vào nhiệt độ
Nhận xét: Từ k ết quả bảng 3.3 và hình 3.3 ta thấy, độ hấp thụ quang
của dung dịch PRC , CFI và PNH ổn định trong khoảng nhiệt độ từ 25 đến 500C, nên có thể tiến hành các thí nghiệm ở khoảng nhiệt độ trên. Do đó chúng tôi lựa chọn nhiệt độ thích hợp để tiến hành thí nghiệm là nhiệt độ phòng (25÷ 300C).
Kết luận chung: Dựa trên các kết quả khảo sát các điều kiện tối ưu cho
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
HCl 0,1M; thời gian đo quang sau khi pha chế là 30 phút và ở nhiệt độ phòng (25350C); khoảng bước sóng đo quang tốt nhất là 210285nm.
3.5. Kiểm tra tính cộng tính độ hấp thụ quang của dung dịch hỗn hợp PRC, CFI và PNH CFI và PNH
Phương pháp trắc quang xác định đồng thời các cấu tử tron g một hỗn hợp mà phổ hấp thụ quang phân tử của chúng xen phủ nhau thì độ hấp thụ quang của các cấu tử trong hỗn hợp phải có tính cộng tính.
Để áp dụng phương pháp trắc quang dùng phổ toàn phần thì độ hấp thụ quang của các chất trong hỗn hợp phải tuân theo định luật cộng tính , do đó cần kiểm tra tính cộng tính độ hấp thụ quang của dung dịch hỗn hợp (PRC, PNH), (CFI, PNH) , (PRC,CFI) và (PRC, CFI, PNH) trong khoảng bước sóng tối ưu đã lựa chọn là từ 210- 285nm.
3.5.1 Kiểm tra tính cộng tính độ hấp thụ quang của dung dịch hỗn hợp PRC và CFI
Tiến hành pha dung dịch P RC có nồng độ 6 µg/mL, dung dịch CFI có nồng độ 6 µg/mL và hỗn hợp của chúng có cùng nồng độ 6 µg/mL. Đo độ hấp thụ quang của các dung dịch ở bước sóng từ 210 nm đến 285 nm; cứ 0,5 nm ghi một giá trị. Cộng phổ riêng phần của hai dung dịch chuẩn P RC và CFI rồi so sánh với phổ hỗn hợp . Đánh giá sự cộng tính độ hấp thụ quang thông qua tính sai số tuyệt đối và sai số tương đối. Kết quả kiểm tra sự cộng tính độ hấp thụ quang ở một số bước sóng cơ bản được trình bày ở bảng 3.4.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Bảng 3.4. Độ hấp thụ quang của PRC, CFI và hỗn hợp ở một số bước sóng (với tỉ lệ nồng độ PRC:CFI là 1:1) ) (nm APRC (6,0 µg/mL) ACFI (6,0 µg/mL) ALT ATN Sai số tuyệt đối Sai số tƣơng đối (%) 210 0,297 0,623 0,920 0,888 0,032 3,478 215 0,208 0,45 0,658 0,644 0,014 2,128 220 0,212 0,282 0,494 0,492 0,002 0,405 225 0,257 0,195 0,452 0,452 0,000 0,000 230 0,309 0,161 0,47 0,471 -0,001 -0,213 235 0,355 0,135 0,49 0,492 -0,002 -0,408 240 0,388 0,106 0,494 0,497 -0,003 -0,607 245 0,393 0,091 0,484 0,488 -0,004 -0,826 250 0,363 0,105 0,468 0,472 -0,004 -0,855 255 0,302 0,146 0,448 0,451 -0,003 -0,670 260 0,229 0,198 0,427 0,427 0,000 0,000 265 0,161 0,25 0,411 0,409 0,002 0,487 270 0,114 0,282 0,396 0,391 0,005 1,263 275 0,088 0,278 0,366 0,36 0,006 1,639 280 0,073 0,234 0,307 0,301 0,006 1,954 285 0,057 0,161 0,218 0,217 0,001 0,459
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Nhận xét: Từ số liệu của bảng 3.4 cho thấy, trong khoảng bước sóng
210 - 285 nm sai số cộng tính độ hấp thụ quang của hỗn hợp P RC và CF I mắc phải không lớn (<4%), cụ thể là sai số tuyệt đối có giá trị từ -0,004 đến 0,032; còn sai số tương đối có giá trị -0,855 đến 3,478. Như vậy, có thể xem phổ của dung dịch PRC và CFI có tính chất cộng tính trên toàn phổ, chính vì vậy từ đó cho phép xác định đồng thời PRC và CFI bằng phương pháp trắc quang dùng phổ toàn phần kết hợp với phương pháp lọc Kalman để xác định được đồng thời hàm lượng PRC và CFI trong các mẫu thuốc.