Thuật toán lọc Kalman đầu tiên được nghiên cứu trong vật lý vô tuyến nhằm loại bỏ các tín hiệu "nhiễu" và sau đó được ứng dụng vào hoá học trắc quang. Thuật toán lọc Kalman hoạt động trên cơ sở các file dữ liệu phổ đó ghi được của từng cấu tử riêng rẽ và của hỗn hợp các cấu tử, xác định sự đóng góp về phổ của từng cấu tử trong hỗn hợp tại các bước sóng. Khi chương trình chạy, những kết quả tính toán liên tiếp sẽ càng tiến gần đến giá trị thực. Trong thực tế, người ta sử dụng phương pháp bình phương tối thiểu để giảm sai số giữa phổ của hỗn hợp với phổ nhân tạo được tiên đoán bởi các xấp xỉ Kalman. Kết quả tính toán là lý tưởng khi phổ của hỗn hợp trừ đi phổ nhân tạo được tính bởi lọc Kalman sẽ tạo ra một đường thằng có độ lệch không đáng kể. Độ đúng của phép xác định phụ thuộc vào độ nhiễu của nền, vào việc tách các đỉnh phổ hấp thụ của các cấu tử và sự tương tác giữa các cấu tử. Hỗn hợp có càng ít cấu tử, các đỉnh hấp thụ càng cách xa nhau thì sai số của phép tính toán sẽ càng nhỏ.
Việc tính toán sẽ được thực hiện trên toàn bộ khoảng bước sóng được chọn. Nếu kết thúc quá trình tính toán, độ lệch chuẩn tương đối của giá trị nồng độ các cấu tử trong hỗn hợp vẫn lớn hơn giá trị sai số cho phép thì nồng độ của cấu tử đó sẽ phải xác định lại. Trong trường hợp đó, cần phải tăng giá trị sai số mặc định hoặc giảm số giá trị nồng độ mặc định để tính giá trị nồng độ trung bình.
Một số tác giả đã sử dụng thuật toán lọc Kalman để xác định các cấu tử trong hỗn hợp bằng phương pháp trắc quang. Kết quả cho thấy sai số của phép xác định với hỗn hợp 2 cấu tử nhỏ hơn 1%, với hỗn hợp 3 cấu tử có sai số nhỏ hơn 2%.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Chƣơng 2 THỰC NGHIỆM
2.1. Nội dung và phƣơng pháp nghiên cứu
2.1.1. Nội dung nghiên cứu
Áp dụng phương pháp phân tích trắc quang để xây dựng quy trình xác định đồng thời paracetamol, cafein, phenylephin hydroclorit trong thuốc giảm đau, hạ sốt panadol trên thị trường.
Các nghiên cứu cụ thể:
- Khảo sát các điều kiện tối ưu và các yếu tố ảnh hưởng đến phép đo quang đối với paracetamol, cafein, phenylephin hydroclorit như môi trường, pH, ảnh hưởng của nhiệt độ, thời gian của dung dịch có độ hấp thụ quang ổn định từ đó lựa chọn khoảng thời gian và nhiệt độ thích hợp để thực hiện các phép đo quang.
- Tiến hành khảo sát sơ bộ phổ hấp thụ phân tử của paracetamol, cafein, phenylephin hydroclorit trong các dung môi có pH=1 đến 3 để tìm dung môi thích hợp cho phép đo quang.
- Kiểm tra tính cộng tính độ hấp thụ quang của hỗn hợp paracetamol, cafein, phenylephin hydroclorit trên toàn phổ.
- Khảo sát khoảng tuyến tính của paracetamol, cafein, phenylephin hydroclorit và xác định giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ).
- Xác định đồng thời paracetamol, cafein, phenylephin hydroclorit trong các mẫu tự pha chế và mẫu thuốc panadol.
- Đánh giá độ tin cậy của phương pháp qua việc tính toán độ đúng và độ lặp lại của phép đo.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
2.1.2. Phương pháp nghiên cứu
- Nghiên cứu các điều kiện tối ưu cho phép đo quang paracetamol, cafein, phenylephin hydroclorit.
- Tiến hành xác định đồng thời 2 chất trong các mẫu giả tự pha. - Tiến hành xác định đồng thời 3 chất trong các mẫu giả tự pha. - Tiến hành xác định đồng thời 3 chất trong mẫu thuốc panadol. - Sử dụng chương trình lọc Kalman để xác định đồng thời các cấu tử trong hỗn hợp.
2.2. Thiết bị, dụng cụ và hóa chất
2.2.1. Thiết bị
- Máy quang phổ UV – 1700 Shimadzu của Khoa Hóa học Trường Đại học Sư phạm – Đại học Thái Nguyên, có khả năng quét phổ trong khoảng bước sóng 190nm – 900 nm, có kết nối máy tính.
- Bộ cuvet thạch anh. - Cân điện tử có độ chính xác 0,0001g. - Bếp cách thủy. 2.2.2. Dụng cụ - Pipet các loại: 1mL, 2mL, 5mL, 10mL, 20mL, 25mL. - Bình định mức dung dịch: 10mL, 25mL, 50mL, 100mL, 500mL, 1000mL.
- Cốc thủy tinh, phễu thủy tinh, ống nghiệm...
- Chương trình lọc Kalman tính toán đồng thời nồng độ các cấu tử [12,23]. - Một số dụng cụ khác.
2.2.3. Hóa chất
- Dung dịch HCl, dung dịch HNO3, dung dịch H2SO4 ... đều thuộc loại tinh khiết của Merck.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
- Chất chuẩn paracetamol, cafein, phenylephin hydroclorit nguyên chất do viện kiểm nghiệm dược sản xuất.
- Thuốc viên panadol được sản xuất tại công ty cổ phần dược phẩm Sanofi - SynthelaboViệt Nam.
2.2.4. Chế phẩm Panadol cảm cúm
Mã sản phẩm: SDK: VD-2246-06
Thành Phần:
Mỗi viên nén chứa: Paracetamol : 500 mg Cafein : 25 mg
Phenylephin Hydroclorit: 5 mg
Chỉ định: Panadol cảm cúm làm giảm đau xoang và các triệu chứng
của cảm cúm như sốt, đau và xung huyết mũi.
2.3. Chuẩn bị các dung môi để hoà tan mẫu
Để hòa tan các mẫu nghiên cứu, chúng tôi đã sử dụng các dung môi sau: - Dung dịch HCl 10-1M; 10-2M; 10-3M.
- Dung dịch H2SO4 5.10-2M; 5.10-3M; 5. 10-4M. - Dung dịch HNO3 10-1M; 10-2M; 10-3M.
Lấy 41,8mL dung dịch HCl 37% (d = 1,18) pha loãng bằng nước cất 2 lần thành 500mL thu được dung dịch HCl 1M (pH = 0). Sau đó pha thành HCl 0,1M, HCl 0,01M và HCl 0,001M.
Lấy 5,5mL dung dịch H2SO4 97% (d = 1,84) pha loãng bằng nước cất 2 lần thành 100mL thu được dung dịch H2SO4 0,5M (pH = 0). Sau đó pha thành H2SO4 0,05M, H2SO4 0,005M và H2SO4 0,0005M.
Lấy 7mL dung dịch HNO3 65% (d = 1,39) pha loãng bằng nước cất 2 lần thành 100mL thu được dung dịch HNO3 1M (pH = 0). Sau đó pha thành HNO3 0,1M, HNO3 0,01M và HNO3 0,001M.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Các dung dịch này đều được xác định lại nồng độ bằng phương pháp chuẩn độ. (các dung dịch sau khi pha đều được kiểm tra và điều chỉnh bằng máy đo pH)
2.4. Đánh giá độ tin cậy của quy trình phân tích
2.4.1. Giới hạn phát hiện (LOD)
Giới hạn phát hiện được coi là nồng độ thấp nhất của chất nghiên cứu mà hệ thống phân tích cho tín hiệu phát hiện phân biệt với tín hiệu nền. Trong phân tích trắc quang LOD tính theo phương trình hồi quy có công thức như sau:
3.SD LOD =
B (2.1)
Trong đó:
SD: là độ lệch chuẩn của tín hiệu y trên đường chuẩn.
B: độ dốc của đường chuẩn chính là độ nhạy của phương pháp trắc quang.
2.4.2 . Giới hạn định lượng (LOQ)
Giới hạn định lượng được coi là nồng độ thấp nhất của chất nghiên cứu mà hệ thống phân tích định lượng được với tín hiệu phân tích khác, có ý nghĩa định lượng với tín hiệu nền và đạt độ tin cậy tối thiểu 95% thường người ta sử dụng công thức:
10.SD LOQ =
B (2.2)
2.4.3. Đánh giá độ tin cậy của phương pháp
- Đánh giá độ đúng của phương pháp đối với các hỗn hợp PRC , CFI và PNH tự pha chế thông qua sai số tương đối RE. Sai số tương đối của các phép phân tích đối với mẫu chuẩn tự pha chế thông qua việc tính tỷ số giữa độ sai lệch của nồng độ tính toán được với nồng độ thực đã biết của mẫu theo công thức:
Tinh toan 0 0 C - C RE% = .100% C (2.3) Trong đó:
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
RE% là sai số tương đối của phép xác định nồng độ các cấu tử. CTinh toan là nồng độ tính toán được từ chương trình lọc Kalman.
C 0(µg/mL) là nồng độ đã biết của dung dịch PRC, CFI và PNH trong hỗn hợp.
- Đánh giá độ đúng của phương pháp đối với các mẫu thuốc nghiên cứu thông qua độ thu hồi bằng phương pháp thêm chuẩn . Độ thu hồi (Rev) được tính theo công thức sau:
T a
C - C
Rev = .100%
a (2.4) Trong đó:
CT: nồng độ (µg/mL) của dung dịch PRC, CFI và PNH xác định được trong mẫu sau khi thêm chuẩn.
Ca: nồng độ (µg/mL) của dung dịch PRC, CFI và PNH xác định được trong mẫu khi chưa thêm chuẩn.
a: nồng độ (µg/mL) của dung dịch chuẩn PRC, CFI và PNH thêm vào mẫu (đã biết).
- Độ lặp lại của phương pháp được đánh giá thông qua độ lệch chuẩn (SD) hoặc độ lệch chuẩn tương đối (RSD).
n n 2 2 i i i=1 i=1 C - μ C - C SD = = k k (2.5) RSD S.100 = (%) C (2.6) Trong đó:
Ci là các giá trị nồng độ (µg/mL) của dung dịch PRC, CFI và PNH tính được lần thứ i.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
là giá trị nồng độ thực của mẫu.
C là giá trị nồng độ trung bình tính được sau n lần xác định. k là số bậc tự do.
2.4.4. Đánh giá kết quả phép phân tích theo thống kê
Khoảng tin cậy của phép xác định nồng độ được tính theo công thức: P,k
t .SD
C ± ε = C ±
n (2.7) Trong đó:
tP, k là hệ số phân bố chuẩn Student ứng với xác suất P và bậc tự do k được tra trong bảng.
C là giá trị trung bình của các giá trị nồng độ . SD: là độ lệch chuẩn được tính theo công thức (2.5). n : là số phép đo.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Chƣơng 3
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. Khảo sát phổ hấp thụ phân tử của paracetamol, cafein và phenylephin hydroclorit phenylephin hydroclorit
Để có thể xác định được paracetamol, cafein và phenylephin hydroclorit
bằng phương pháp trắc quang thì paracetamol, cafein và phenylephin hydroclorit phải hấp thụ quang trong khoảng bước sóng khảo sát. Vì vậy chúng tôi tiến hành khảo sát phổ hấp thụ phân tử và bước sóng cực đại của paracetamol, cafein và phenylephin hydroclorit.
Pha dung dịch P RC nồng độ 8 µg/mL, CFI nồng độ 8 µg/mL, PNH nồng độ 15 µg/mL trong HCl 0,1 M. Sau đó tiến hành quét phổ của các dung dịch đó trong khoảng bước sóng từ 200 đến 900 nm. Kết qu ả phổ hấp thụ quang phân tử của PRC, CFI và PNH ở bước sóng 210 - 285 nm được thể hiện ở hình 3.1.
Hình 3.1. Phổ hấp thụ quang của dung dịch chuẩn PRC(1), CFI(2) và PNH(3)
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Nhận xét: Từ kết quả thu được cho thấy PRC có độ hấp thụ quang cực đại tại λ = 244 nm, CFI có độ hấp thụ quang cực đại tại bước sóng λ = 272 nm còn PNH có độ hấp thụ quang cực đại tại λ = 273 nm. Phổ hấp thụ quang của PRC, CFI và PNH xen phủ nhau gần như hoàn toàn, gây khó khăn cho việc xác định đồng thời PRC, CFI và PNH trong hỗn hợp. Trên cơ sở khảo sát trong khoảng bước sóng 285 - 900 nm nhận thấy PRC, CFI và PNH gần như không hấp thụ ánh sáng. Mặt khác ở 200 – 210 nm thì giá trị lại rất lớn. Vì vậy, chúng tôi lựa chọn khoảng bước sóng để thực hiện các phép đo độ hấp thụ quang của dung dịch PRC, CFI và PNH trong khoảng 210 - 285 nm để tiến hành các nghiên cứu tiếp theo.
3.2. Khảo sát sự phụ thuộc độ hấp thụ quang của PRC, CFI và PNH vào pH
Pha chế 3 dãy dung dịch gồm 9 mẫu dung dị ch PRC có nồng độ 8 µg/mL, 9 mẫu dung dịch CFI và 9 mẫu dung dịch PN H có nồng độ 8 µg/mL trong các môi trường HCl, H2SO4, HNO3 có pH=1, pH=2, pH=3.
Sau đó chúng tôi tiến hành đo độ hấp thụ quang ở bước sóng cực đại của PRC là 244 nm, của CFI là 272 nm và của PN H là 273 nm ở nhiệt độ 250C. Bảng 3.1 là kết quả độ hấp thụ quang ở thời điểm 30 phút sau khi pha của PRC, CFI và PNH ở các giá trị pH.
Bảng 3.1. Độ hấp thụ quang của PRC, CFI và PNH ở các giá trị pH
Môi trường HCl HNO3 H2SO4
pH 1 2 3 1 2 3 1 2 3
A
PRC 0,521 0,519 0,510 0,518 0,511 0,497 0,520 0,535 0,501 CFI 0,396 0,394 0,391 0,369 0,367 0,360 0,409 0,403 0,400 PNH 0,070 0,069 0,063 0,074 0,073 0,062 0,065 0,066 0,065 Nhận xét: Từ kết quả thu được ở bảng 3.1 chúng tôi thấy rằng: Đối với PRC, CFI và PNH độ hấp thụ quang tương đối ổn định trong môi trường axit HCl. Tuy
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
nhiên, kết quả nghiên cứu sơ bộ cho thấy khoảng tuyến tính và độ tan cũng như độ hấp thụ quang của PRC, CFI và PNH đạt cực đại trong môi trường axit HCl 0,1M. Do đó, chúng tôi chọn môi trường để nghiên cứu thuận lợi cho cả PRC, CFI và PNH là dung dịch HCl 0,1M.
3.3. Khảo sát sự phụ thuộc độ hấp thụ quang của PRC, CFI và PNH theo thời gian thời gian
Để khảo sát xem thờ i gian có ảnh hưởng đến độ hấp thụ quang của PRC, CFI và PNH như thế nào chúng tôi tiến hành khảo sát độ hấp thụ quang của PRC, CFI và PNH trong khoảng thời gian 90 phút sau khi pha . Công việc khảo sát cụ thể như sau:
Pha dung dịch PRC, dung dịch CFI và dung dịch PNH trong HCl 0,1M có nồng độ 8µg/mL, đo độ hấp thụ quang của các dung dịch ở bước sóng 210 - 285nm; cứ 5 phút ta đo 1 lần. Độ hấp thụ quang trung bình (3 lần đo) ở bước sóng cực đại của PRC (244nm), CFI (272nm) và PNH (273nm) được trình bày ở bảng 3.2.
Bảng 3.2. Sự phụ thuộc độ hấp thụ quang của PRC, CFI và PNH theo thời gian
Thời gian (phút) 5 10 15 20 25 30 35 40 45 A PRC 0,524 0,524 0,523 0,522 0,521 0,521 0,521 0,521 0,521 CFI 0,394 0,395 0,395 0,395 0,396 0,396 0,396 0,396 0,396 PNH 0,071 0,071 0,071 0,071 0,070 0,070 0,070 0,070 0,070 Thời gian (phút) 50 55 60 65 70 75 80 85 90 A PRC 0,521 0,521 0,521 0,521 0,521 0,521 0,521 0,521 0,521 CFI 0,396 0,396 0,396 0,396 0,396 0,396 0,396 0,396 0,396 PNH 0,070 0,070 0,070 0,070 0,070 0,070 0,070 0,070 0,070
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Từ kết quả bảng 3.2 xây dựng được đường biểu diễn sự phụ thuộc của độ hấp thụ quang A theo thời gian có dạng như hình 3.3.
Hình 3.2. Sự phụ thuộc độ hấp thụ quang của PRC(1), CFI(2), PNH(3) theo thời gian
Nhận xét: Từ kết quả ở bảng 3.2 và hình 3.2 nhận thấy, trong khoảng
thời gian 90 phút sau khi pha, độ hấp thụ quang của các dung dịch PRC, CFI và PNH tương đối ổn định . Sự thay đổi chủ yếu ở khoảng thời gian 5 25 phút sau khi pha, sự thay đổi là không đáng kể. Như vậy, có thể nói các dung dịch PRC, CFI và PNH có độ hấp thụ quang ổn định trong khoảng thời gian từ 2590 phút sau khi pha. Các phép đo chúng tôi đều thực hiện từ 30 40 phút sau khi pha là thích hợp.
3.4. Khảo sát sự phụ thuộc độ hấp thụ quang của PRC, CFI và PNH theo nhiệt độ nhiệt độ
Để khảo sát sự thay đổi độ hấp thụ quang của PRC, CFI và PNH theo sự thay đổi của nhiệt độ chúng tôi ti ến hành pha các dung dịch chuẩn PRC, CFI và PNH có nồng độ 8µg/mL, trong HCl 0,1M. Sau đó đo độ hấp thụ quang của các dung dịch ở bước sóng 210 - 285nm, trong khoảng nhiệt độ khảo sát 25-500
C. Độ hấp thụ quang trung bình (3 lần đo ) ở bước sóng cực đại của PRC (244nm), CFI (272nm) và PNH (273nm) được trình bày ở bảng 3.3.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Bảng 3.3 Sự phụ thuộc độ hấp thụ quang của PRC, CFI và PNH theo nhiệt độ
Nhiệt độ (0 C) 25 30 35 40 45 50 A PRC(244nm) 0,519 0,521 0,521 0,523 0,522 0,525 CFI(727nm) 0,397 0,393 0,396 0,394 0,394 0,401 PNH(273nm) 0,070 0,070 0,070 0,071 0,069 0,071 Từ kết quả bảng 3.3. xây dựng đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc độ hấp thụ quang PRC, CFI và PNH theo nhiệt độ. Kết quả được thể hiện ở hình 3.3.