3.2.1. Lựa chọn các locus STR sử dụng trong QF-PCR
Việc lựa chọn các locus STR sử dụng trong các bộ kit QF-PCR chẩn đoán lệch bội NST rất quan trọng. Các locus phải này phải đảm bảo có khả năng đưa ra thông tin để kết luận về số lượng của NST.
Tổng kết giai đoạn 1 thực hiện trên 110 mẫu của nghiên cứu này, có 32 trường hợp disomy (chiếm 29,1%; 32/110) nhưng các locus D13S325 (13G), D18S391(18A), D21S2039 (21E), D21S1412 (21F) ở dạng dị hợp tử với tỉ số tín hiệu rfu giữa 2 alen nằm trong khoảng không kết luận được là trisomy hay disomy (0,65 – 0,74 hoặc 1,55 – 1,75) (hình 3.1). Hiện tượng cạnh tranh giữa các primer của các locus trong cùng 1 hỗn hợp phản ứng PCR làm cho các alen khuếch đại không hiệu quả có thể là nguyên nhân gây ra tình trạng này.
Hình 3.1. Các locus ở dạng dị hợp tử với tỉ số tín hiệu không kết luận được.
Các trường hợp này đã được báo cáo với Trung tâm nghiên cứu và phát triển của hãng sản xuất. Các báo cáo này cũng phù hợp với các báo cáo của trung tâm chẩn đoán khác. Vì thế hãng sản xuất đã điều chỉnh và đưa ra phiên bản 2, các locus 13G, 18A, 21E, 21F đã bị loại ra và thay thế bằng các locus
mới là D13S1492 (13K), D18S1364 (18P), D21S1442 (21H), D21S2055 (21J) (bảng 3.2). Sau khi thay thế các locus mới, không còn xảy ra hiện tượng tỉ số tín hiệu rfu nằm trong khoảng không thể kết luận được.
Ngoài ra, trong giai đoạn 1 nghiên cứu còn gặp trường hợp các mẫu không có NST Y nhưng các locus NST X lại ở dạng 1 đỉnh, không thể kết luận được là 1 alen – monosomy X hay 2 alen đồng hợp tử - disomy X vì các locus DXS1187 (X1), DXS981 (X2), XHPRT (X3) có độ dị hợp tử không cao. Hiện tượng này đã được phản ánh với hãng sản xuất. Trong phiên bản 2, nhà sản xuất đã thêm vào 2 locus của NST X là DXYS218 (XY3) và DXS2390 (X9) và 1 cặp locus 3p24.2 và Xq21.1 (T3) để so số lượng NST X với NST 3. Nhóm nghiên cứu đã thống nhất sử dụng Devyser Complete phiên bản 2 cho tất cả các mẫu của nghiên cứu này. Những mẫu đã làm bằng phiên bản 1 ở giai đoạn 1 được khảo sát lại bằng phiên bản 2.
Bảng 3.2. Các locus bị loại ra và các locus STR được thêm vào ở phiên bản 2.
Locus thêm vào Locus loại ra
Ký hiệu Locus Độ DHT Ký hiệu Locus Độ DHT 13K D13S1492 0,68 13G D13S325 0,83 18P D18S1364 0,88 18A D18S391 0,63 21H D21S1442 0,80 21E D21S2039 0,61 21J D21S2055 0,90 21F D21S1412 0,88 XY3 DXYS218 0,68 X9 DXS2390 0,36 T3 3p24.2 Xq21.1
3.2.2. Tối ưu các thông số xét nghiệm
Nếu điện di sản phẩm PCR trên máy điện di mao quản ABI 3130 theo hướng dẫn của Devyser là: điện thế bơm mẫu (IV) 2,5 kV, thời gian bơm mẫu (IT) 20 giây, ống mao quản 50 cm, thì tín hiệu thường sẽ rất cao > 6.000 rfu không đạt tiêu chuẩn phân tích; đỉnh sóng thường bị chẻ đôi định lượng gen không chính xác (hình 3.2). Điều này xảy ra là do có quá nhiều sản phẩm PCR được bơm vào ống mao quản với vận tốc cao.
Sau nhiều lần thử nghiệm với các điều kiện khác nhau, kết quả điện di tối ưu ở IV 2,3 kV và IT 14 giây, ống mao quản 50 cm. Đỉnh sóng không bị chẻ đôi, cường độ 100–6.000 rfu phù hợp với tiêu chuẩn phân tích (hình 3.3).
Hình 3.2. Kết quả điện di theo hướng dẫn của nhà sản xuất với IV 2,5 kV, IT 20”.
Hình 3.3. Kết quả điện di theo sau khi tối ưu với IV 2,3 kV, IT 20”.
Máy điện di mao quản ABI 3500 là máy thế hệ mới, nhà sản xuất ch ưa có hướng dẫn thông số điện di sản phẩm PCR. Chúng tôi đã thiết lập được
chu trình điện di mao quản trên máy này dựa trên cơ sở của điện di phân tích đoạn nhưng với IV tăng lên 2,7 kV, IT 23 giây, ống mao quản 50 cm. Với thông số này các kết quả đều đạt tiêu chuẩn phân tích.
Thời gian ra kết quả: Trừ 2 mẫu nhiễm DNA mẹ phải cấy loại nhiễm mới thực hiện QF-PCR có thời gian ra kết quả là 2 tuần, tất cả các mẫu còn lại đều có kết quả QF-PCR sau 36 – 48 giờ. Trong khi đó, thời gian có kết quả của NST đồ là 16 – 20 ngày, FISH là 48 – 72 giờ. Nếu QF-PCR được áp dụng vào chẩn đoán trước sinh sẽ giảm áp lực cho người thực hiện kỹ thuật, giảm chờ đợi, căng thẳng cho thai phụ và gia đình.