3.4.1. Kết quả QF-PCR
Trong lần thực hiện XN đầu tiên bằng 2 hỗn hợp PCR cho mỗi mẫu, có 398 mẫu cho kết quả phân tích có thể kết luận được với hơn 2 locus cho thông tin trên 1 NST. Có 2 mẫu có kết quả không bình thường nhưng không thể kết luận được số lượng NST, gồm 1 trường hợp không thể kết luận NST X và 1 trường hợp NST 21. Bảng 3.9 trình bày kết quả QF-PCR theo phân loại bất thường và độ tuổi thai phụ.
Có 36 trường hợp có kết quả QF-PCR bất thường, chiếm tỉ lệ 9,0% (36/400). Trong đó, trisomy 13, trisomy 18 và trisomy 21 chiếm đa số.
Trisomy 21 có tỉ lệ là 2,8% (11/400) cao hơn các bất thường khác như trisomy 18 (2,5%; 10/400), trisomy 13 (1,5%; 6/400) và monosomy X.
Nhóm thai phụ < 35 tuổi có tỉ lệ thai bất thường NST là 9,3% (25/268) cao hơn so với nhóm 35 tuổi là 8,3% (11/132) nhưng lại có tỉ lệ thai trisomy
21 thấp hơn (2,6% so với 3,0%). Trong khi tỉ lệ Trisomy 13 và Trisomy 18 lại ở nhóm < 35 tuổi cao hơn nhóm 35 tuổi (lần lượt 19% và 2,6% so với 0,8% và 2,3%). Điều này xảy ra có thể do số mẫu bất thường trong nghiên cứu này không nhiều và chưa mang tính đại diện.
Bảng 3.9. Kết quả chẩn đoán bằng QF-PCR theo tuổi thai phụ.
Tuổi thai phụ < 35 tuổi 35 tuổi Tổng Kết quả QF-PCR Số lượng Tỉ lệ % Số lượng Tỉ lệ % Số lượng Tỉ lệ % Bình thường 243 90,7 121 91,7 364 91,0 Bất thường 25 9,3 11 8,3 36 9,0 Trisomy 13 5 1,9 1 0,8 6 1,5 Trisomy 18 7 2,6 3 2,3 10 2,5 Trisomy 21 7 2,6 4 3,0 11 2,8 Monosomy X 2 0,7 - - 2 0,5 XXY hoặc XYY 1 0,4 1 0,8 2 0,5 Triploidy 2 0,7 1 0,8 3 0,8 Không kết luận 1 0,4 1 0,8 2 0,5 Tổng 268 100 132 100 400 100
Trong hai mẫu không kết luận được, một trường hợp chọc ối vì có tiền căn sinh con Hc Down, trường hợp còn lại có XN sàng lọc trước sinh quý 2 nguy cơ cao. Kết quả QF-PCR phân bố theo chỉ định chọc ối được mô tả bảng 3.10.
Bảng 3.10. Kết quả QF-PCR theo chỉ định chọc ối.
Tiền căn con DTBS XN quý 1 NC cao XN quý 2 NC cao Siêu âm có bất thường Có yếu tố NC cao Số lượng Tỉ lệ % Số lượng Tỉ lệ % Số lượng Tỉ lệ % Số lượng Tỉ lệ % Số lượng Tỉ lệ % Bình thường 9 90,0 100 93,5 106 94,6 129 88,4 20 80,0 Bất thường 1 10,0 7 6,5 6 5,4 17 11,6 5 20,0 Trisomy 13 - - - - - - 5 3,4 1 4,0 Trisomy 18 - - 3 2,8 1 0,9 5 3,4 1 4,0 Trisomy 21 - - 2 1,9 4 3,6 4 2,7 1 4,0 Monosomy X - - 1 0,9 - - - - 1 4,0 XXX hoặc XXY - - 1 0,9 - - 1 0,7 - - Triploidy - - - - - - 2 1,4 1 4,0 Không kết luận 1 10,0 - - 1 0,9 - - - - Tổng 10 100 107 100 112 100 146 100 25 100
Nhóm có nhiều yếu tố nguy cơ cao có tỉ lệ bất thường là 20% (5/25), cao hơn so với các nhóm khác.
Nhóm chỉ định chọc ối vì có DTBS hoặc có dấu hiệu rối loạn NST trên siêu âm có tỉ lệ bất thường cao thứ nhì 11,6% (17/146). Trong đó, tỉ lệ trisomy 13 và trisomy 18 là 3,4% (5/146) cao hơn tỉ lệ trisomy 21 (2,7%; 4/146). Điều này phù hợp với đặc điểm kiểu hình của trisomy 13 và 18 thường gây nhiều dấu hiệu DTBS hơn trisomy 21.
Trong nhóm chỉ định chọc ối vì XN sàng lọc quý 2 có NC cao, trisomy 21 có tỉ lệ cao nhất là 3,6% (4/112). Trong khi đó, trisomy 18 lại có tỉ lệ cao nhất 2,8% (3/107) trong nhóm XN sàng lọc quý 1 có NC cao. Điều này có thể là do hiện tượng sẩy sớm của các thai trisomy 18 và trisomy 13 nhiều hơn so với trisomy 21.
1 mẫu không kết luận được do tiền căn sinh con Hc Down có kết quả bất thường dạng khảm XX/X0 (tỉ số 2:3). 1 mẫu không kết luận được có NC cao bị trisomy 21 là 1/200 phát hiện qua XN sàng lọc quý 2.
3.4.2. So sánh kết quả QF-PCR với Karyotye
Kết quả QF-PCR của 400 mẫu nghiên cứu được so sánh và đối chiếu với kết quả karyotype, kết quả được tóm tắt ở bảng 3.11. Theo đó, kỹ thuật QF-PCR cho kết quả 398 trường hợp, đạt tỉ lệ 99,5% (398/400).
Mức độ tương hợp giữa kết quả bình thường và bất thường của QF- PCR với kết quả karyotype là 100%.
Tất cả các thai trisomy 21 phát hiện bằng QF-PCR đều có kết quả karyotype là trisomy thể điều hòa 47,XX,+21 hoặc 47,XY,+21.
Bảng 3.11. Sự tương hợp giữa kết quả QF-PCR với kết quả karyotype.
Karyotype QF-PCR
Kết quả Số lượng Kết quả Số lượng
Tỉ lệ % tương hợp Bình thường 364 364 100 46,XY 201 Disomy, XY 201 46,XX 163 Disomy,XX 163 Bất thường 36 36 100
Trisomy 13 47,XY,+13 2 T13,XY 2
47,XX,+13 3 T13,XX 4
46,XX,-13,+t(13/13) 1
Trisomy 18 47,XY,+18 5 T18,XY 5
47,XX,+18 4 T18,XX 5
46,XX,dup(18) 1
Trisomy 21 47,XY,+21 8 T21,XY 8
47,XX,+21 3 T21,XX 3 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Monosomy X 45,X 2 Monosomy X 2
Trisomy X 47,XXX 1 XXX 1
Klinefelter 47,XXY 1 XXY 1
Triploidy 69,XXX 2 Triploidy, XXX 2
69,XXY 1 Triploidy, XXY 1
Khảm Không kết quả (FISH: XX/XO, tỉ số 2:3) 1 Không kết luận 2 46,XX/47,XX,+21, tỉ số 3:1 1 Tổng 400 400
Các trường hợp trisomy 18 và trisomy 13 đều có kết quả karyotype phù hợp. QF-PCR không thể phát hiện nguyên nhân do rối loạn cấu trúc của 2 trường hợp trisomy, trong đó 1 trường hợp là 46,XX,dup(18) (trisomy 18 do 1 NST 18 bị nhân đôi) và 1 trường hợp 46,XX,-13,+t(13/13) (trisomy 13 do có 2 NST 13 chuyển đoạn hòa nhập tâm). Không thể phát hiện bản chất cấu trúc NST là hạn chế của QF-PCR.
Trường hợp 46,XX,dup(18) trên QF-PCR có 2 locus đồng hợp tử không cho thông tin và 4 locus còn lại trên NST 18 có 2 alen với tỉ lệ 2:1. Điều này gợi ý nguyên nhân trisomy là do có sự nhân đôi 1 NST 18. Hình hình 3.6, locus NST 18 được đánh dấu bằng mũi tên.
Hình 3.6. Kết quả QF-PCR và karyotype của mẫu 46,XX,dup(18).
Một trường hợp QF-PCR có tín hiệu các locus NST giới tính không bình thường, nhưng không thể kết luận loại bất thường. Không may, kỹ thuật karyotype cũng không có kết luận đối với mẫu này do quá trình nuôi cấy thất bại vì mẫu bị nhiễm nấm. Sử dụng kỹ thuật FISH để khảo sát cho thấy mẫu này bị monosomy X thể khảm, XX/X0 với tỉ số là 2:3. Đối chiếu lại với kết quả QF-PCR của mẫu này cho thấy: không có tín hiệu NST Y; 2 locus XY2
và X2 có 2 alen không bằng nhau với tỉ lệ 1,87 và 0,66; locus 7X: NST 7 nhiều hơn NST X tỉ lệ 1,27 (hình 3.7 a và b).
Hình 3.7. Kết quả QF-PCR và FISH trường hợp monosomy X thể khảm.
3.4.3. Độ nhạy và độ đặc hiệu của QF-PCR
Nếu xem 2 trường hợp không kết luận được vì có kiểu gen thể khảm là trường hợp bị bỏ sót thì QF-PCR có độ nhạy 94,4% (34/36), độ đặc hiệu là 100% (364/364), giá trị tiên đoán dương là 100% (34/34) và giá trị tiên đoán âm là 99,5% (364/366) (bảng 3.12).
a
Bảng 3.12. So sánh kết quả QF-PCR với kết quả karyotype, 2 mẫu không kết luận được xem là bình thường.
Karyotype Bất thường Bình thường Tổng Bất thường 34 0 34 QF-PCR Bình thường (bao gồm 2 trường hợp
Không kết luận được)
2 364 366
Tổng 36 364 400
Tuy nhiên, nếu xếp 2 mẫu không thể kết luận vào nhóm bất thường (vì trong thực tế, 2 mẫu này có tín hiệu QF-PCR không bình thường) thì QF-PCR có độ nhạy là 100% (36/36), độ đặc hiệu là 100% (364/364), giá trị tiên đoán dương là 100% (36/36), giá trị tiên đoán âm là 100% (366/366) (bảng 3.13).
Bảng 3.13. So sánh kết quả QF-PCR với kết quả karyotype kết hợp, 2 mẫu không kết luận được xem là bất thường.
Karyotype và FISH
Bất thường Bình thường
Tổng
Bất thường
(bao gồm 2 trường hợp
Không kết luận được)
36 0 36
QF-PCR (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Bình thường 0 364 364
Tổng 36 364 400
3.4.4. Khả năng phát hiện ngoại nhiễm DNA mẹ và song thai cùng hợp tử
QF-PCR phát hiện 2 trường hợp bị ngoại nhiễm DNA mẹ với hình ảnh điện di cho thấy các tín hiệu của locus có độ cao không đều nhau. Tổng độ của cao của 2 tín hiệu thấp bằng với tín hiệu cao ở tất cả các locus có 3 tín hiệu (hình 3.8a). Tuy nhiên, sau 2 tuần nuôi cấy ối loại nhiễm tế bào máu mẹ, mẫu ối được thu hoạch và chạy QF-PCR thì hình ảnh nhiễm máu mẹ không còn (hình 3.8b).
Khả năng phát hiện được nhiễm máu mẹ là đặc tính vượt trội của QF- PCR so với các phương pháp chẩn đoán lệch bội nhanh khác (FISH, MLPA), đặc biệt đối với những thai nữ.
Hình 3.8. Kết quả QF-PCR mẫu ối nhiễm DNA mẹ trước (a) và sau (b) nuôi cấy.
Trong nghiên cứu có 1 trường hợp song thai 2 buồng ối, không rõ số lượng nhau. Dịch ối của 2 buồng ối đều được chọc hút và XN riêng biệt. Kết quả QF-PCR cho thấy 2 thai này có alen giống nhau ở tất cả các locus khảo sát. Vì thế, có thể kết luận đây là song thai cùng hợp tử. So sánh với kết quả karyotype là 46,XX ở cả 2 thai. Khả năng đánh giá những trường hợp đa thai một hay nhiều hợp tử là giá trị cộng thêm của QF-PCR, giúp loại nhiễm tế bào giữa các mẫu, theo dõi và tiên lượng thai trên lâm sàng.
a) b)
CHƯƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
KẾT LUẬN
Qua kết quả nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật QF-PCR vào chẩn đoán nhanh trước sinh rối loạn nhiễm sắc thể ở người và căn cứ trên mục tiêu, nghiên cứu được kết luận như sau:
1. Nghiên cứu đã xác định được các locus STR thích hợp cho phản ứng QF-PCR để phát hiện các trường hợp lệch bội nhiễm sắc thể số 13 (D13S252, D13S305, D13S634, D13S742, D13S800), số 18 (D18S386, D18S535, D18S976, D18S978, D18S1002, D18S1364, GATA178F11), số 21 (D21S11, D21S1411, D21S1435, D21S1442, D21S1444, D21S2055) và nhiễm sắc thể giới tính (DXYS267 DXS1187 DXS981 XHPRT DXS2390).
2. Các locus STR được lựa chọn cho phản ứng QF-PCR có từ 5 đến 30 loại alen với tỉ lệ dị hợp tử cao trên 70%. Có hiện tượng vi nhân đoạn xảy ra ở 2 locus trên nhiễm sắc thể 13 là D13S742 và D13S634.
3. Mức độ tương hợp giữa kết quả bình thường và bất thường của kỹ thuật QF-PCR với kết quả karyotype là 100%. Kỹ thuật QF-PCR có độ đặc hiệu, giá trị tiên đoán dương, giá trị tiên đoán âm đều đạt 100%. Khả năng trả lời kết quả cho các mẫu xét nghiệm bằng QF-PCR là 99,5% với thời gian trung bình từ 36 đến 48 giờ.
ĐỀ NGHỊ
1. Sử dụng QF-PCR để chẩn đoán nhanh trước sinh rối loạn số lượng nhiễm sắc thể 13, 18, 21 và nhiễm sắc thể giới tính thay thế cho karyotype trong những trường hợp thai kỳ có nguy cơ cao lệch bội nhiễm sắc thể được
phát hiện qua tuổi mẹ, xét nghiệm sàng lọc trước sinh hoặc có dấu chứng trên siêu âm.
2. Thực hiện thêm xét nghiệm bằng kỹ thuật karyotype cho các trường hợp tín hiệu QF-PCR không thể kết luận số lượng nhiễm sắc thể để không bỏ sót các trường hợp lệch bội thể khảm.
3. Sử dụng phối hợp kỹ thuật QF-PCR với kỹ thuật karyotype để chẩn đoán nhanh số lượng và khảo sát cấu trúc nhiễm sắc thể trong các trường hợp: (1) thai phụ hoặc chồng mang rối loạn cấu trúc nhiễm sắc thể; (2) thai bịđa dị tật bẩm sinh không thuộc nhóm lệch bội nhiễm sắc thể 13, 18, 21 và giới tính.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1 Bảo_Trịnh Văn Bảo & Trần Thị Thanh Hương. (2011). Di truyền y học. Nhà xuất bản giáo dục Việt Nam.
2 Cirigliano, V., Sherlock, J., Conway, G., Quilter, C., Rodeck, C. & Adinolfi, M. (1999). Rapid detection of chromosomes X and Y aneuploidies by quantitative fluorescent PCR. Prenatal Diagnosis, 19, 1099-1103.
3 Hoàng_Bùi Võ Minh Hoàng, Nguyễn Duy Tài & Phan Chiến Thắng. (2006). Ứng dụng kỹ thuật lai tại chỗ huỳnh quang trong chẩn đoán trước sinh các dị
bội nhiễm sắc thể thường gặp.
4 Hương_Trần Thị Thanh Hương, Hoàng Thu Lan, Hoàng Thị Ngọc Lan,
Nguyễn Thị Quỳnh Thơ & Cường, N. D. (2007). Chẩn đoán trước sinh hội
chứng Down, hội chứng Turner bằng kỹ thuật lai tại chỗ huỳnh quang kết hợp
phân tích nhiễm sắc thể của tế bào ối. Tạp chí Nghiên cứu Y học, 47, 4-8. 5 Huyền_Nguyễn Thúy Huyền, Triệu Tiến Sang & Nguyễn Duy Bắc. (2011).
Nghiên cứu áp dụng kỹ thuật QF - PCR trong một số bất thường nhiễm sắc (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
thể. Tạp chí Y Dược học Quân sự, 5, 34.
6 Khôi_Nguyễn Thành Khôi. (2011). Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật MLPA để
phát hiện lệch bội nhiễm sắc thể 13 18, 21. Luận văn cao học chuyên ngành di truyền. Đại học Khoa học tự nhiên, Thành phố Hồ Chí Minh.
7 Lan_Hoàng Thị Ngọc Lan, Nguyễn Việt Hùng, Trần Danh Cường, Trịnh Văn
Bảo & Hương, T. T. T. (2006). Phân tích nhiễm sắc thể của tế bào ối nuôi cấy có đối chiếu với kết quả của siêu âm thai và test sàng lọc trước sinh. Tạp chí
Nghiên cứu Y học, 1, 47-53.
8 Lan_Hoàng Thu Lan, Trần Thị Thanh Hương & Lan, H. T. N. (2006). Hoàn chỉnh kỹ thuật lai tại chỗ huỳnh quang và bước đầu ứng dụng trong chẩn đoán trước sinh hội chứng Down. Tạp chí Nghiên cứu Y học, 1, 35-41.
9 Liên_Mai Thu Liên. (2009). Ứng dụng kỹ thuật FISH phát hiện lệch bội nhiễm
sắc thể trên mẫu gai nhau. Đại học y dược TP HCM.
10 Phòng Di truyền - Bệnh viện Từ Dũ. (2008). Báo cáo tổng kết hoạt động. Bệnh
viện Từ Dũ: Thành phố Hồ Chí Minh.
11 Thơ_Nguyễn Quỳnh Thơ. (2011). Sàng lọc và chẩn đoán trước sinh hội chứng Turner. Đại học Y Hà Nội.
12 Trung_Cung Bỉnh Trung & Cung Hồng Sơn. (2007). Khái niệm về bệnh lý di
truyền ở người. Nhà xuất bản Y học: Hà Nội.
13 Applied Biosystems. (2010). Applied Biosystems 3500/3500XL Genetic Analyzer User Guide. Applied Biosystems.
14 Badenas, C., Rodriguez-Revenga, L., Morales, C., Mediano, C., Plaja, A., Perez-Iribarne, M. M., et al. (2010). Assessment of QF-PCR as the first approach in prenatal diagnosis. J Mol Diagn, 12(6), 828-834.
15 Bili, C., Divane, A., Apessos, A., Konstantinos, T., Apostolos, A., Ioannis, B., et al. (2002). Prenatal diagnosis of common aneuploidies using quantitative fluorescent PCR. Prenat Diagn, 22(5), 360-365.
16 Bray, I., Wright, D. E., Davies, C. & Hook, E. B. (1998). Joint estimation of Down syndrome risk and ascertainment rates: a meta-analysis of nine published data sets. Prenat Diagn, 18(1), 9-20.
17 Brown, L., Abigania, M., Warburton, D. & Brown, S. (2006). Validation of QF-PCR for prenatal aneuploidy screening in the United States. Prenat Diagn, 26(11), 1068-1074.
18 Caine, A., Maltby, A. E., Parkin, C. A., Waters, J. J. & Crolla, J. A. Prenatal detection of Down's syndrome by rapid aneuploidy testing for chromosomes 13, 18, and 21 by FISH or PCR without a full karyotype: a cytogenetic risk assessment. The Lancet, 366(9480), 123-128.
19 Chitty, L. S., Kistler, J., Akolekar, R., Liddle, S., Nicolaides, K. & Levett, L. (2011). Multiplex ligation-dependent probe amplification (MLPA): a reliable alternative for fetal chromosome analysis? J Matern Fetal Neonatal Med. 20 Chiu, R. W. & Lo, Y. M. (2002). Application of fetal DNA in maternal plasma
for noninvasive prenatal diagnosis. Expert Rev Mol Diagn, 2(1), 32-40.
21 Cho, E. H., Park, B. Y., Kang, Y. S. & Lee, E. H. (2009). Validation of QF- PCR in a Korean population. Prenat Diagn, 29(3), 213-216.
22 Cirigliano, V., Canadas, P., Plaja, A., Ordonez, E., Mediano, C., Sanchez, A., et al. (2003). Rapid prenatal diagnosis of aneuploidies and zygosity in multiple pregnancies by amniocentesis with single insertion of the needle and quantitative fluorescent PCR. Prenat Diagn, 23(8), 629-633.
23 Cirigliano, V., Voglino, G., Canadas, M. P., Marongiu, A., Ejarque, M., Ordonez, E., et al. (2004). Rapid prenatal diagnosis of common chromosome aneuploidies by QF-PCR. Assessment on 18,000 consecutive clinical samples. Mol Hum Reprod, 10(11), 839-846.
24 Cirigliano, V., Voglino, G., Marongiu, A., Canadas, P., Ordonez, E., Lloveras, E., et al. (2006). Rapid prenatal diagnosis by QF-PCR: evaluation of 30,000