2.2.1. Phương pháp tiến hành
2.2.1.1. Quy trình chọn mẫu
Các thai phụ lần đầu đến khám thai và tư vấn tại Đơn vị Chẩn đoán trước sinh bệnh viện Từ Dũ được bác sĩ đánh giá kết quả sàng lọc trước sinh (double test, triple test, siêu âm, khoảng mờ gáy, tiền sử bản thân hoặc gia đình có rối loạn nhiễm sắc thể). Những trường hợp thai có nguy cơ cao
1/250 được bác sĩ tư vấn về chọc ối, xét nghiệm bằng kỹ thuật karyotype như thường quy và tham gia vào xét nghiệm bằng kỹ thuật QF-PCR.
Sau thủ thuật chọc ối, mẫu sẽ được chia ra làm 2 phần riêng biệt: phần lớn để thực hiện karyotype là kết quả chính thức trả cho bệnh nhân; phần dư còn lại được đưa vào nghiên cứu kỹ thuật QF-PCR. Kết quả QF-PCR nghiên cứu sẽ được đối chiếu với tiêu chuẩn vàng là kết quả karyotype.
Các trường hợp thai có bất thường NST sẽ được chuyển Hội đồng tư vấn trước sinh để được tư vấn. Nếu thai phụ và gia đình đề nghị chấm dứt thai kỳ thì sẽ được thực hiện theo phác đồ của bệnh viện và quy định của Bộ Y tế. Quy trình chọn mẫu và nghiên cứu được thực hiện theo sơ đồ 2.1.
Lưu đồ 2.1. Quy trình chọn mẫu và thực hiện nghiên cứu.
2.2.1.2. Phương tiện thực hiện nghiên cứu
* Dụng cụ, hóa chất và thiết bị dùng trong nghiên cứu
Ống chứa dung dịch ối Falcon 15 mL và bình cấy ối 25 mL (BD Bioscience). Ống ly tâm vô trùng 1,5 mL, 0,5 mL, ống PCR thành mỏng 0,2 mL, đầu tip có lọc các thể tích từ 0,2 – 1000 µl (Axygen).
Kit ly trích DNA máu và dịch ối QIAamp DNA Blood Mini Kit® (Qiagen).
Môi trường nuôi cấy dịch ối: Amniomax C100 Basal Medium®, Amniomax C100 Supplement®, FBS, Antibiotic-Antimycotic 100x, Trypsin-EDTA 0,25%, Colcemid 10 ug/mL (Invitrogen).
Hi-Di Formamide, GeneScan 500 ROX (Applied Biosystems).
Kit Devyser Complete và Devyser Resolution® (Devyser AB).
Thiết bị
Micropipette các loại thể tích từ 0,2 – 1000µl (Eppendorf).
Máy luân nhiệt Mastercycler Pro S® (Eppendorf).
Máy định lượng DNA Biophotometer plus® (Eppendorf).
Hệ thống giải trình tự ABI 3130® và ABI 3500® (Applied Biosystems).
Máy ly tâm ống 15 mL, máy ly tâm ống 1,5 mL, máy vortex, bể ủ cách thủy (Memmert).
Tủ cấy CO2 Heracell 150® (Heraeus).
Kính hiển vi Eclipse 80i® (Nikon);
Hệ thống phân tích nhiễm sắc thể Metapher® và Ikaros® (MetaSystems).
Máy vi tính, máy in, phần mềm phân tích đoạn DNA GeneMarker® (SoftGenetics), PowerStat (Promega), Micrsoft Office 2003.
Máy ly tâm Máy ủ nhiệt khô có lắc
Máy định lượng DNA Máy luân nhiệt
Tủ ủ CO2 Micropipette
(adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Hệ thống phân tích NST Máy giải trình tự gen ABI 3500
* Xét nghiệm karyotype
Quy trình kỹ thuật karyotype và lấy mẫu dịch ối được thực hiện thường quy tại bệnh viện Từ Dũ từ năm 1999.
Quy trình lấy mẫu dịch ối tại Đơn vị Chẩn đoán trước sinh:
Thủ thuật được thực hiện bởi các bác sĩ được huấn luyện và bệnh viện phân công với hướng dẫn của siêu âm.
Siêu âm xác định tình trạng thai, nhau, ối, vùng thủ thuật và đường đi của kim. Đảm bảo vùng đâm kim không bị viêm nhiễm.
Sát khuẩn vùng đâm kim bằng cồn và betadine, trải khăn lỗ thủ thuật sạch che vùng da xung quanh, chừa lại vùng thủ thuật.
Dưới sự hướng dẫn của siêu âm, dùng kim gây tê tủy sống 18G đưa qua thành bụng vào buồng ối. Sử dụng ống tiêm 1 mL hút ra 1 mL dịch ối đầu tiên, quan sát màu sắc và toàn trạng bệnh nhân. Rút ống tiêm ra khỏi kim chọc hút và bỏ ống tiêm này đi.
Dùng ống tiêm 10 mL mới hút ra 10 mL dịch ối và cho vào ống Falcon 15 mL vô trùng. Đậy nắp ống dịch ối thật chặt.
Rút kim ra khỏi thành bụng và băng kín nơi đâm kim.
Ghi nhận thể tích, màu sắc và đặc điểm của dịch ối thu thập được và chuyển mẫu đến Khoa Xét nghiệm Di truyền Y học trong ngày.
Siêu âm kiểm tra tình trạng thai, dặn dò bệnh nhân trước khi kết thúc.
Tại Khoa xét nghiệm di truyền y học, 10 mL dịch ối được chia làm hai phần, một phần 8 mL để nuôi cấy tế bào ối xét nghiệm karyotype và một phần 2 mL để xét nghiệm QF-PCR.
Quy trình nuôi cấy tế bào ối
Quay ly tâm 8 mL dịch ối, tốc độ 1500 vòng/phút trong 10 phút. Bỏ phần dịch trong bên trên và thu 2 mL cặn, trộn đều rồi cho vào bình
cấy có sẵn 4 mL Amniomax/C-Complement/FCS. Chuyển vào tủ cấy ở điều kiện 370C và 5% CO2.
Sau 7 ngày, lấy mẫu ra khỏi tủ cấy, quan sát sự phát triển của tế bào bằng kính hiển vi đảo ngược với độ phóng đại x40. Khi tế bào phát triển và bám dính vào đáy bình cấy thì thay môi trường mới trường mỗi 2 ngày. Sau 2 lần thay môi trường, tế bào phát triển đủ số lượng và đạt mức tinh sạch cần thiết thì tiến hành thu hoạch tế bào ối.
Đồng bộ hóa tế bào bằng cách cho 0,1 mL colchicine 0,004% vào bình cấy, ủ thêm 2 giờ. Sau đó, đổ bỏ môi trường, cho 1 mL Trypsin EDTA 1/125 vào bình cấy, rửa bằng môi trường Amniomax và thu dịch vào ống Falcon 15 mL.
Tiếp tục làm bong lớp tế bào bằng 2 mL trypsine-EDTA 1/125 và ủ trong bể ổn nhiệt ở 370C từ 10 đến 15 phút rồi thu dịch vào ống Falcon nói trên.
Quay ly tâm dịch thu được với tốc độ 1500 vòng/phút trong 10 phút. Bỏ phần dịch trong bên trên và thu 1 mL cặn lắng tế bào.
Sốc nhược trương tế bào bằng 7 mL dung dịch KCl 0,75M và ủ trong bể ổn nhiệt 370 C từ 30 – 45 phút, ly tâm, thu 1 mL cặn lắng tế bào.
Cố định tế bào bằng cách nhỏ 6 mL Carnoy (1 axít acetic : 3 methanol) vào phần cặn sau sốc nhược trương, đánh tan, ly tâm, thu 1 mL cặn lắng. Lặp lại bước này 2 lần.
Nhỏ tiêu bản và nướng tiêu bản ở nhiệt độ 600 C qua đêm hoặc 800 C trong 30 phút.
Nhuộm band G với Giemsa-Trypsin (GTG): tùy theo nhiệt độ, độ ẩm và tuổi tiêu bản, thời gian nhuộm Trypsin 0,1% dao động từ 7 – 15 giây, sau đó nhuộm Giemsa 10% trong 8 – 10 phút.
Phân tích dưới kính hiển vi với thị kính x10 và vật kính dầu x100. Các cụm kỳ giữa đạt tiêu chuẩn phân tích là những cụm có NST phân
tán tốt, không nằm chồng lên nhau, kích thước NST không quá ngắn, các vệt băng rõ.
Các cụm NST được phân tích về số lượng và cấu trúc, đánh giá NST bình thường hay đột biến số lượng hoặc đột biến cấu trúc theo hệ thống ISCN 2009 (An International System for Human Cytogenetic Nomenclature) [61]. Mỗi mẫu được phân tích 30 cụm kỳ giữa và lập karyotype ít nhất 10 cụm kỳ giữa. Những trường hợp khảm thì phải phân tích 100 cụm NST.
In và trả kết quả phân tích cho bệnh nhân.
* Xét nghiệm QF-PCR
Kỹ thuật QF-PCR được thực hiện theo lưu đồ sau. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Lưu đồ 2.2. Tiến trình thực hiện kỹ thuật QF-PCR.
Bước 1: Ly trích DNA từ mẫu. DNA được ly trích từ 2 mL dịch ối bằng phương pháp cột lọc sử dụng QIAamp DNA Blood Mini Kit® theo hướng dẫn của nhà sản xuất [57]. Toàn bộ quy trình được thực hiện tại khu vực riêng biệt lập, tuân thủ quy trình chống nhầm lẫn, chống ngoại nhiễm DNA [63]. DNA sau ly trích được đánh giá nồng độ và chất lượng bằng máy DNA Biophotometer plus rồi giữ ở 40C nếu xét nghiệm ngay hoặc -300C nếu lưu trữ lâu dài.
Bước 2: Chuẩn bị mẫu PCR mix. Mỗi mẫu sẽ được thực hiện trong 2 phản ứng PCR đa mồi riêng biệt trong bộ Devyser complete. Phản ứng 1 có 14 locus, phản ứng 2 có 19 locus đặc hiệu NST 13, 18, 21, X và Y (bảng 2.1, hình 2.2) [28]. Phản ứng gồm 20 uL hỗn hợp PCR mix và 5 uL DNA (3 ng/µL) trong ống PCR thành mỏng 0,2 mL.
Bảng 2.1. Các locus đặc hiệu nhiễm sắc thể được khảo sát trong các phản ứng.
STT Kí hiệu Locus Vị trí trên NST Độ dài (bp) Màu huỳnh quang Phản ứng PCR 1 1 13A D13S742 13q12.12 232-327 Lục 2 13B D13S634 13q21.32 365-435 Xanh 3 13C D13S628 13q31.3 425-474 Vàng 4 13D D13S305 13q13.3 435-505 Lục 5 13K D13S1492 13q21.1 113-185 Vàng 6 18B D18S978 18q12.3 195-230 Vàng 7 18C D18S535 18q12.3 300-350 Xanh 8 18D D18S386 18q22.1 338-430 Lục 9 18M GATA178F11 18p11.32 350-410 Vàng 10 18P D18S1364 18q22.1 130-205 Lục 11 21A D21S1435 21q21.3 150-208 Xanh 12 21B D21S11 21q21.1 215-290 Xanh 13 21C D21S1411 21q22.3 245-345 Vàng 14 21D D21S1444 21q22.13 440-495 Xanh Phản ứng PCR 2 1 13E D13S800 13q22.1 180-230 Vàng 2 13F D13S252 13q12.2 255-320 Xanh 3 18D D18S386 18q22.1 338-430 Lục 4 18G D18S1002 18q11.2 325-380 Xanh 5 18J D18S976 18p11.31 430-487 Vàng 6 21G D21S1446 21q22.3 430-490 Lục 7 21H D21S1442 21q21.3 362-420 Vàng 8 21J D21S2055 21q22.2 385-485 Xanh 9 X1 DXS1187 Xq26.2 120 - 170 Lục 10 X2 DXS981 Xq13.1 262 - 300 Lục 11 X3 XHPRT Xq26.2-26.3 265 - 308 Vàng 12 X9 DXS2390 Xq27.1-q27.2 312 - 357 Vàng 13 XY2 DXYS267 Xq21.31 / Yp11.31 175 - 217 Xanh 14 XY3 DXYS218 Xp22.33 / Yp11.32 215 - 260 Lục 15 AMELXY AMELX AMELY Xp22.2 Yp11.2 X = 104 Y = 110 Xanh 16 ZFYX ZFY ZFX Yp11.31 Xp22.11 151 - 160 Vàng
17 SRY SRY Yp11.31 233 Xanh
18 T1 7q34 Xq13 7 = 179 X = 200 Lục 19 T3 3p24.2 Xq21.1 3 = 133 X = 137 Xanh
Khi kết quả của 2 phản ứng PCR không đủ thông tin để kết luận, thì mẫu sẽ được phân tích thêm một phản ứng PCR đa mồi khác với các
locus của NST cần khảo sát. Trong phản ứng PCR này, ngoài các locus giống như ở hỗn hợp phản ứng 1 và 2 còn có thêm 1 số locus khác (bảng 2.2, hình 2.2) [27].
Bảng 2.2. Các locus đặc hiệu nhiễm sắc thể được khảo sát thêm khi cần thiết.
STT Kí hiệu Locus Vị trí trên NST Độ dài (bp) Màu huỳnh quang 1 18I D18S858 18q21.31 360-415 Vàng 2 21I D21S1437 21q22.2 105-150 Vàng 3 X4 DXS6809 Xq21.33 290-340 Xanh 4 X5 DXS6854 Xq26.1 392-430 Lục 5 X6 DXS8377 Xq28 430-500 Xanh 6 X8 DXS6803 Xq21.31 100-140 Xanh
7 Y2 DYS448 Yq11.223 346-380 Xanh
8 T2 T2 Xq23
2p23.2
X=114 2=118
Vàng
Như vậy có 5 locus không thuộc loại STR. Trong đó locus AMELX/AMELY (gen Amelogenin X,Y) và locus gen SRY được sử dụng để xác định sự hiện diện của NST Y và so sánh với số lượng NST X. Các locus có ký hiệu T1, T2 và T3 dùng để so sánh số lượng NST X với số lượng NST số 2, 3 và 7.
Bước 3: Phản ứng luân nhiệt. Các phản ứng PCR đều được thực hiện trên máy luân nhiệt Master Cycler Pro theo chu trình như sau:
1. 950C x 15 phút x 1 chu kỳ 2. 940C 580C 720C x 30 giây x 1 phút 30 giây x 1 phút 40 giây x 26 chu kỳ 3. 720C x 30 phút x 1 chu kỳ 4. 40C x giữ vô hạn
Hình 2.2. Vị trí các locus STR trên các NST 13, 18, 21, X, Y và các NST khác. 18M (GATA178F11) 18J (D18S976) 18G (D18S1002) 18B (D18S978) 18I (D18S858) 18P (D18S1364) 18C (D18S535) 18D (D18S386) 13A (D13S742) 13F (D13S252) 13E (D13S800) 13K (D13S1492) 13B (D13S634) 13D (D13S305) 13C (D13S628) X6 (DXS8377) T1 X2 (DXS981) T3 X8 (DXS6803) XY2 (DXYS267) X9 (DXS2390) X4 (DXS6809) ZFYX (ZFX) AMELXY (AMELX) X3 (XHPRT) X1 (DXS1187) X5 (DXS6854) XY3 (DXYS218) T2 XY3 (DXYS218) XY2 (DXYS267) ZFYX (ZFY) SRY AMELXY (AMELY) Y2 (DYS448) Y 21B (D21S11) 21A (D21S1435) 21H (D21S1442) 21D (D21S1444) 21I (D21S1437) 21J (D21S2055) 21C (D21S1411) 21G (D21S1446) 21 T3 3 T2 2 T1 7
Bước 4: Điện di mao quản. Sản phẩm PCR sau luân nhiệt được phân tách đoạn bằng điện di mao quản máy ABI 3130 hoặc ABI 3500 với mao quản 50 cm.
Hỗn hợp mẫu điện di gồm: 14,5 uL Hi-Di Formamide, 0,5 uL GeneScan 600 Liz Size Standard (hoặc 560 Sizer Orange) và 1,5 uL sản phẩm PCR.
Thông số điện di được cài đặt như sau: mao quản 50 cm, POP7, điện thế bơm mẫu: 2,7 kV, thời gian bơm mẫu: 20 giây; điện thế điện di: 19,5 kV ; thời gian điện di: 1.700 giây.
Bước 5: Phân tích kết quả. Dữ liệu sau khi điện di mao quản được xuất dưới dạng tập tinfsa và phân tích bằng phần mềm GeneMarker 1.85. Các tiêu chuẩn phân tích, đánh giá được thực hiện theo ‘Hướng dẫn thực hành chẩn đoán lệch bội bằng QF-PCR, phiên bản 3.01 năm 2012’ của Hiệp hội Di truyền Phân tử Lâm sàng và Di truyền Tế bào Lâm sàng Vương quốc Anh và hướn dẫn sử dụng của Devyser Complete (tóm tắt trong bảng 2.3) [28],[48]. Theo đó:
Chỉ phân tích các locus có tín hiệu từ 50 rfu (relative fluorescent unit) đến 6.000 rfu, các locus nằm ngoài khoảng này bị loại bỏ.
Các locus dị hợp tử có nhiều hơn 1 alen được phân tích bằng cách tính tỉ số độ cao của các tín hiệu (peak height) (tín hiệu của alen ngắn hơn với tín hiệu của alen dài hơn).
Kết luận về số lượng NST phụ thuộc vào tỉ số và chênh lệch về chiều dài giữa các alen trong cùng một locus (bảng 2.3). Nếu chênh lệch chiều dài giữa 2 alen < 24 bp thì áp dụng tiêu chuẩn 1, nếu 24 bp thì sử dụng tiêu chuẩn 2.
Một NST được xác định là disomy khi có ít nhất 2 locus của NST đó ở dạng dị hợp tử 2 alen với tỉ số định lượng giữa 2 alen là 1:1.
Bảng 2.3. Đánh giá tỉ số giữa các alen trong cùng một locus.
Tỉ số giữa các alen Locus 2 alen 1:2 Không kết (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
luận được 1:1
Không kết
luận được 2:1
Tiêu chuẩn 1 < 0,65 0,65 – 0,74 0,75 – 1,44 1,45 – 1,75 > 1,75
Tiêu chuẩn 2 < 0,65 0,65 – 0,74 0,75 – 1,54 1,55 – 1,75 > 1,75
Locus 3 alen Không kết luận được 1:1:1 Không kết luận được
Tiêu chuẩn 1 < 0,74 0,75 – 1,44 > 1,45
Tiêu chuẩn 2 < 0,74 0,75 – 1,54 > 1,55
Một NST được xác định là trisomy khi có ít nhất 2 locus của NST đó dị hợp tử 3 alen với tỉ số 1:1:1 hoặc 2 alen với tỉ số 2:1 hoặc 1:2.
Một NST được xác định là monosomy khi tất cả các locus của NST đó chỉ có 1 alen.
Xác định monosomy X khi tất cả các locus của NST X chỉ có 1 alen; locus amelogenin chỉ có tín hiệu của X, locus của NST Y không có tín hiệu, locus 7X có tỉ số 2:1; locus T2 có tỉ số 1:2.
Các trường hợp không kết luận được sẽ được lưu ý khả năng mẫu xét nghiệm có bất thường như: khảm, trisomy bán phần, ngoại nhiễm DNA, vi lập đoạn ngắn của 1 locus.
2.2.1.3. Phiếu thu thập thông tin nghiên cứu
Phiếu thu thập thông tin được soạn sẵn với nội dung cần thiết về hành chánh, nhân khẩu học, tiền sử y khoa bản thân và gia đình, kết quả xét nghiệm sàng lọc, kết quả siêu âm, nguy cơ rối loạn NST, kết quả chẩn đoán karyotype, kết quả chẩn đoán QF-PCR.
2.2.1.4. Nhân lực thực hiện nghiên cứu
Nhóm nghiên cứu trực tiếp thực hiện các công đoạn kỹ thuật xét nghiệm karyotype và xét nghiệm QF-PCR gồm 4 bác sĩ và 6 cử nhân sinh học. Các bác sĩ thực hiện chọc ối chẩn đoán trước sinh là những bác sĩ đã được huấn luyện thành thạo và được bệnh viện phân công thực hiện. Vì thế hạn chế tối đa việc mẫu dịch ối bị nhiễm máu mẹ.
2.2.2. Y đức
Thực hiện nghiên cứu này không vi phạm vấn đề y đức vì được thực hiện dựa trên sự tự nguyện tham gia. Đối tượng được chọn có quyền từ chối tham gia nghiên cứu bất cứ khi nào. Nếu từ chối tham gia, họ vẫn được hướng dẫn theo dõi và điều trị bình thường như những người khác.
Các XN chẩn đoán không gây hại đối với thai. Thủ thuật chọc hút dịch ối dưới siêu âm dẫn đường được thực hiện tại bệnh viện Từ Dũ từ năm 1999 đến