2.2.1.3 Streptococcus
Streptococcus là cầu khuẩn hoặc trực khuẩn rất ngắn, chủ yếu lên men lactic
đồng hình, kết song đôi hoặc thành chuỗi ngắn. Giống ưa ấm, nhiệt độ phát triển tối thiểu là 100C, tối đa là 40 – 450C và phát triển tốt ở 30 – 350C. Trong môi trường nó tích tụ được 0.8 – 1% acid. Một số chủng tạo thành bacteriocin.
Một số dạng Streptococcus thường dùng để lên men lactic như:
Streptococcus lactis: là liên cầu khuẩn Gram (+). Nhiệt độ phát triển từ 10 –
450C, có thể chịu được nồng độ NaCl 4%. Khi lên men đường glucose, maltose, lactose, xylose, arabinose, saccharose, trehalose, monnitol tạo ra acid lactic, CO2, acid acetic, diacetyl. Chúng có khả năng lên men được raffinose, inulin, glycerol, sorbitol. Chúng được sử dụng rộng rãi trong chế biến các sản phẩm như sữa chua,
cream – bơ chua, phomai. Streptococus lactic có khả năng lên men 300C đối với sữa, đường glucose, mantose, lactose, galactose.
Streptococcus cremoris: là tế bào hình cầu và kết thành chuỗi dài, ưa ấm và
tạo ít acid trong môi trường. Nhiệt độ thích hợp cho phát triển là 250C, tối thiểu là 100C, tối đa là 36 – 380C.
Streptococcus thermophilus: có dạng hình cầu, kết thành chuỗi dài, phát triển
tốt ở nhiệt độ 40 – 450C, tích tụ khoảng 1% acid. Thường dùng phối hợp với trực khuẩn lactic để chế biến sữa chua và các loại đặc biệt, sữa chua nấu chín và phomai.
Streptococcus falcalis: là tế bào Gram (+), chúng thường tạo thành chuỗi tế
bào hình cầu, có khả năng chịu được nồng độ NaCl 5%, có khả năng lên men đường glucose, maltose, lactose, trehalose, silicin, sorbitol [3].
Gần đây, người ta nghiên cứu sản xuất phomai từ sữa dừa dưới tác dụng của
vi khuẩn Streptococcus diacetylactis. Giống được bảo quản trong môi trường sữa và
giữ trong tủ đông. Nhiệt độ nuôi cấy sinh trưởng và lên men mạnh nhất khi nuôi cấy ở 280C, phát triển khá ở 350C và thấp nhất ở 200C. Sau nhiều thử nghiệm cho thấy môi trường tốt nhất là môi trường sữa bột gầy bổ sung glucose và nước chiết nấm men.
Streptococcus diacetylactis còn được gọi là Pneumococci, là cầu khuẩn Gram
(+), xếp từng đôi hay thành chuỗi, có vỏ bằng polysaccharide. Pneumococci dễ bị ly
giải bởi những chất hoạt động bề mặt như muối mật. Thường trú ở đường hô hấp trên của người và có thể gây viêm phổi, viêm xoang, viêm phế quản, nhiễm khuẩn máu, viêm màng não,... Hình dạng: thể điển hình xếp từng đôi, hình ngọn giáo, Gram(+). Ở bệnh phẩm đàm hay mủ, vi khuẩn đứng riêng lẻ hay xếp thành chuỗi. Khi trở nên già thì biến thành Gram (-) và dễ tự ly giải.
2.2.2. Đặc điểm chung của Lactobacillus acidophilus và lên men lactic 2.2.2.1 Đặc điểm của Lactobacillus acidophilus 2.2.2.1 Đặc điểm của Lactobacillus acidophilus
Lactobacillus acidophilus thuộc:
Giới: Bacteria Ngành: Fermicutes Lớp: Bacilli Bộ: Lactobacillilales Họ: Lactobacillaceae Giống: Lactobacillus
Tên vi sinh vật: Lactobacillus acidophilus
Lactobacillus acidophilus: là trực khuẩn lên men lactic đồng hình, chịu nhiệt,
nhiệt độ tối thích cho sinh trưởng là 37 – 400C, tối thiểu là 200C. Trực khuẩn này được phân lập từ ruột trẻ em và bê mới đẻ. Một số chủng có khả năng tạo thành màng nhầy. Trong thiên nhiên chúng tồn tại riêng lẻ, đôi khi chúng tạo thành những chuỗi ngắn, có khả năng chuyển động. Chúng có khả năng lên men 1 số loại đường glucose, fructose, galactose, mannose, maltose, lactose, saccharose để tạo ra acid lactic. Chúng hoàn toàn không có khả năng lên men xylose, arabinose, rahamnose, glycerol, sorbitol, dulcitol, inositol. Trong quá trình lên men chúng tạo ra cả 2 dạng
đồng phân quang học của acid lactic. Lactobacillus acidophilus có khả năng sống 2
ngày trong dịch vị, 5 ngày trong dịch mật tinh khiết, 8 ngày trong dịch tràng.
Lactobacillus acidophilus được coi là loại Probiotic thông dụng nhất, hay là
loại vi khuẩn có ích. Loại vi khuẩn có lợi này cư trú tại ruột, âm đạo để bảo vệ chống lại sự xâm nhập hay gia tăng của các sinh vật “có hại” có thể gây bệnh. Sự phân rã
của thức ăn do khuẩn L. acidophilus sản xuất ra acid lactic, hydrogen peroxide… tạo
ra sự phản ứng của môi trường chống lại các sinh vật không ưa thích.
L. acidophilus cũng sản xuất ra lactase, loại enzyme có khả năng phá huỷ
đường sữa (lactose) thành các loại đường đơn giản.
Lactobacillus acidophilus sản xuất acid lactic và các chất diệt khuẩn
bacteriocin như lactocidin, ngăn cản sự xâm nhập và ức chế sự tăng sinh của các vi
Lactobacillus acidophilus đóng vai trò sinh lý quan trọng nhờ tổng hợp các vitamin,
có khả năng bền vững với 40 loại kháng sinh[3].
2.2.2.2 Lên men lactic
Lên men lactic là quá trình chuyển hoá đường thành acid lactic nhờ vi sinh vật, điển hình là vi khuẩn lactic. Lên men lactic là 1 trong những loại hình lên men phát triển nhất trong thiên nhiên.
Lên men lactic là 1 quá trình trao đổi năng lượng. Các phân tử ATP được hình thành trong quá trình chuyển hoá cơ chất (lactose) sẽ được vi khuẩn giữ lại trong tế bào để phục vụ cho quá trình trao đổi chất và sinh trưởng của vi sinh vật. Ngược lại các sản phẩm như acid lactic, ethanol, CO2 được vi khuẩn thải vào môi trường lên men. Kết quả là hàm lượng acid lactic tích luỹ trong môi trường lên men ngày càng tăng, làm giảm pH môi trường và kéo theo những biến đổi lý hoá khác.
Trong quá trình lên men lactic, ngoài sản phẩm là acid lactic, acid acetic, ethanol, CO2 trong dịch lên men còn xuất hiện cả trăm hợp chất hoá học mới khác. Chúng là sản phẩm trung gian hoặc sản phẩm phụ của quá trình lên men. Hàm lượng của chúng trong dịch lên men thường rất thấp (vài ppm hoặc ít hơn). Một số hợp chất trong nhóm trên rất dễ bay hơi. Chúng đóng vai trò quan trọng trong việc góp phần hình thành nên mùi vị đặc trưng cho những sản phẩm lên men lactic.
Khi nồng độ của acid lactic đạt 2 – 3% sẽ ức chế hoạt động của các vi sinh vật
khác, kể cả E.coli. Chính vì thế nên lên men lactic được ứng dụng để sản xuất nhiều
sản phẩm khác nhau như: sữa chua, bơ, phomai, dưa chua… Phương trình tóm tắt của quá trình lên men lactic:
C6H12O6 → 2C3H6O3 + 136 Kj (32,4 Kcal). Lên men lactic gồm có lên men đồng hình và lên men dị hình
Lên men đồng hình: Lượng acid lactic tạo thành chiếm hơn 90%, chỉ 1 lượng nhỏ pyruvat bị khử carbon chuyển thành acid acetic, ethanol, CO2 và acetoin. Lượng sản phẩm phụ tạo ra phụ thuộc sự có mặt của oxy.
Các chủng vi sinh vật được sử dụng trong lên men đồng hình như:
Lactobacterium delbruckii… Phương trình tổng quát trong quá trình lên men đồng
hình:
C6H12O6 + 2ADP + 2Pi → 2CH3CHOHCOOH + 2ATP
Trong một số trường hợp, lên men đồng hình có thể được chuyển sang dạng dị hình khi điều kiện lên men thay đổi.
Lên men dị hình: Chỉ có 50% lượng đường tạo thành acid lactic, ngoài ra còn có các sản phẩm phụ khác nhau như acid acetic, ethanol, CO2, các sản phẩm phụ tương tác với nhau tạo thành ester có mùi thơm. Phương trình tổng quát trong quá trình lên men dị hình:
C6H12O6 → CH3CHOHCOOH + CH3COOH + C2H5OH
Lượng sản phẩm phụ tạo thành hoàn toàn phụ thuộc vào giống vi sinh vật, môi trường dinh dưỡng và điều kiện ngoại cảnh. Acid lactic thường chiếm 40% lượng đường đã được phân huỷ, acid suecinic 20%, rượu etylic 10%, acid acetic 10% và các loại khí gần 20%
2.2.2.3 Đặc điểm chung của các chủng vi sinh vật lên men lactic
Vi khuẩn lactic thuộc họ Lactobacilliaceae. Acid lactic được phát hiện vào
năm 1780 nhờ nhà hóa học Sheele người Thụy Điển, ở sữa chua, acid lactic được thừa nhận là sản phẩm của quá trình lên men vào năm 1847 [5].
Vi khuẩn lactic thuộc vi khuẩn Gram (+), không di động, không có khả năng tạo bào tử (tuy nhiên hiện nay người ta đã tìm thấy một số giống thuộc họ vi khuẩn lactic có khả năng tạo bào tử).
Vi khuẩn lactic thuộc vi khuẩn hiếu khí tùy tiện, không chứa cytochrom và enzyme catalase, có khả năng sinh tổng hợp enzyme peroxydase rất mạnh. Chúng phân giải H2O2 để tạo ra H2O và O2 để phát triển.
Theo khóa phân loại của Bergay, họ Lactobacilliaceae chia làm 2 họ:
Streptococeae và Lactobacileae.
Streptococeae lại chia ra Streptococcus và Leuconostoc. Lactobacileae chỉ có 1 loài là Lactobacillus
khuẩn lactic như Streptococcus có khả năng gây bệnh. Nhóm vi khuẩn lactic rất đa
dạng gồm nhiều giống rất khác nhau, tế bào của chúng có thể là hình cầu, hình que, phân biệt chúng về khả năng lên men đồng hình hay dị hình. Khả năng tổng hợp nhiều hợp chất cần cho sự sống của những vi khuẩn này rất yếu [4].
Các loài vi khuẩn lactic khác nhau tạo thành acid lactic trong môi trường và như vậy sức chịu acid cũng khác nhau. Đa số các trực khuẩn lactic đồng hình tạo thành acid cao hơn (khoảng 2 – 3,5%), liên cầu khuẩn (khoảng 1%). Các trực khuẩn này có thể phát triển ở pH: 3.8 – 4, cầu khuẩn không thể phát triển ở môi trường này. Hoạt lực lên men tốt nhất ở vùng pH: 5.5 – 6.0.
Đa số vi khuẩn lactic, đặc biệt là trực khuẩn đồng hình rất kén chọn thành phần dinh dưỡng trong môi trường và chỉ phát triển được trong môi trường có tương đối đầy đủ các acid amin hoặc các hợp chất nito phức tạp. Ngoài ra chúng còn nhu cầu về vitamin (B1, B2, B6, PP), các acid pantotenic và folic. Bởi vậy, môi trường nuôi vi khuẩn lactic có thành phần khá phức tạp [5].
Vi khuẩn lactic chịu được ở trạng thái khô hạn, bền vững với CO2 và cồn etylic, nhiều loài vẫn sống được trong môi trường có 10 – 15% cồn hoặc cao hơn, một số trực khuẩn bền với NaCl (tới 7 – 10%).
Các vi khuẩn lactic ưu ấm có nhiệt độ sinh trưởng tối thích là 25 – 350C, các loài ưa nhiệt có nhiệt độ tối thích là 40 – 450C, ưa lạnh phát triển ở nhiệt độ tương đối thấp (50C hoặc thấp hơn). Khi gia nhiệt tới 60 – 800C hầu hết chúng bị chết sau 10 – 30 phút. Sự phát triển của nó cần có sự có mặt của peptone, acid amin hay muối amôn. Chúng có yêu cầu đặc biệt về chất dinh dưỡng là giàu vitamin, acid amin và khoáng chất. Quá trình lên men xảy ra tốt nhất trong môi trường acid pH từ 5.5 – 6, khi pH nhỏ hơn 5.5 quá trình lên men bị dừng lại.
Vi khuẩn lactic có hoạt tính proteaza: phân hủy được protein của sữa thành các peptid và acid amin. Hoạt tính này ở các loài là khác nhau, thường là trực khuẩn cao hơn. Vi khuẩn lactic lên men được đa số disacarit.
Chúng có khả năng lên men nhiều loại đường đơn và đường đôi nhưng không
có khả năng lên men các loại glucid phức tạp và tinh bột, chỉ có loài L. delbrueckii là
Một số loài có khả năng tạo thành màng nhầy. Một số khác có khả năng đối kháng với thể hoại sinh và các vi sinh vật gây bệnh hoặc làm thối rửa thực phẩm. Như vậy, ngoài khả năng tạo thành acid lactic, các loài này còn sinh ra các hợp chất có hoạt tính kháng sinh (người ta gọi các hợp chất này là bacteriocin). Những chất kháng sinh này không dùng trong y học mà chỉ được dùng trong bảo quản thực phẩm có hiệu quả khả quan. Các vi khuẩn lactic ngoài việc tạo thành acid còn có 1 số loài
tạo được chất thơm (diacetyl, acetoin, acid bay hơi…) như Streptococcus
diacetylactic.
Vi khuẩn Lactobacillus có thể làm giảm hội chứng nhạy cảm đường ruột. Các
vi khuẩn này có nhiệm vụ biến đổi chất xơ thực phẩm, thức ăn chưa tiêu hóa hết ở ruột non thành acid lactic, acetic, butyric, hàng loạt vitamin, acid amin, men, hocmon và các chất dinh dưỡng quan trọng khác, sinh ra các khí như NH3, CO2, H2S…
2.2.2.4 Ứng dụng của Lactobacillus acidophilus
Lactobacillus acidophilus còn là loại Probiotic thông dụng nhất, hay là loại vi
khuẩn có ích. Loại vi khuẩn có lợi này cư trú tại ruột, âm đạo để bảo vệ, chống lại sự xâm nhập hay gia tăng của các vi sinh vật có hại có thể gây bệnh. Đây là cơ chế hoạt động hoàn hảo.
Ví dụ, sự phân rã của thức ăn do khuẩn L. acidophilus sản xuất ra acid lactic,
hydrogen peroxide… tạo ra sự phản ứng của môi trường chống lại các sinh vật không ưa thích.
L. acidophilus cũng sản xuất ra lactase, loại enzyme có khả năng phá huỷ
Hình 12: Vi khuẩn Lactobacillus acidophilus [48].
2.2.3. Các sản phẩm lên men lactic
Trong tự nhiên có rất nhiều sản phẩm được lên men lactic như:
Đồ uống Boza: Boza là đồ uống thông dụng ở Anbani, Bulgari, Serbia, Montenegro, Macedonia, Thổ Nhĩ Kỳ. Thức uống này được làm từ bột bắp, lúa mì và gạo, là chất lỏng có độ nhớt cao, chứa acid lactic và cồn khoảng dưới 1% được tạo ra trong quá trình lên men. Boza có màu vàng nhạt, vị chua ngọt tùy theo các nước khác nhau [23].
Bột bắp, bột mì, bột gạo được phối trộn tương ứng với tỷ lệ (2 : 1 : 1) → nấu sôi hỗn hợp với 5 lần nước trong 1 giờ, khuấy liên tục → làm mát về nhiệt độ phòng qua đêm → chất sệt được pha loãng với tỷ lệ 2,5 : 1, thêm 20% đường và trộn kỹ → cấy 2% chủng từ Boza mua thành phẩm ở chợ → vô trùng bình tam giác 1 lít chứa 500ml hỗn hợp đã cấy chủng → nuôi ở 300C. Quá trình lên men được theo dõi trong vòng 40 giờ.
Thức uống Amazake: là loại rượu của Nhật Bản được lên men từ gạo mà chủ
yếu là gạo lức. Amazake sử dụng Lactobacillus làm vi sinh vật lên men. Sản phẩm
có tinh bột, oligosarccharide, lactose, sữa nguyên kem [16].
Vật liệu và phương pháp: Chúng tôi trình bày thứ đồ uống tương tự Amazake của tác giả Yuij ODA và các cộng sự.
Gạo (16g) ngâm trong 24 giờ → cho thêm nước cất trong 30 phút → nấu chín ở 1050C trong 20 phút → làm lạnh, thêm dung dịch nuôi cấy Lactobacillus
amylovorus vào → đường hóa ở 550C trong 24 giờ ở pH = 4.2 → sản phẩm
Môi trường nuôi Lactobacillus amylovorus gồm: 2% sữa không kem, 0,1%
cao men (pH = 6,8), 1% glucose, sucrose, tinh bột hoặc bắp khô, nước 100ml. Khử trùng ở 1050C trong 30 phút (nếu dùng bắp thì khử trùng ở 1500C trong 4 giờ). Khảo sát sự tác động của nguyên liệu và điều kiện lên men
Từ kết quả khảo sát tác động của nhiệt độ lên pH, nồng độ acid lactic và nồng độ đường hòa tan trong dịch thu được cho thấy sự đường hóa ở 370C và 450C trong 24 giờ, vi khuẩn lactic đã tạo acid lactic một cách có hiệu quả từ đường (thủy phân từ tinh bột của gạo nấu chín). Hậu quả là dịch chứa nồng độ cao acid lactic làm xấu đi giá trị cảm quan và vị chua quá mạnh không thể chấp nhận. Ngược lại dịch đường hóa ở 600C, không còn vị chua cho sự lên men lactic acid bị ức chế bởi nhiệt độ cao. Điều kiện tốt nhất là nhiệt độ đạt 550C, pH = 4.2, hàm lượng acid lactic là 1,89g/ml và độ Brix của dung dịch đường là 8,7 [16] .
Đồ uống Sobia: là loại đồ uống được lên men từ bột malt và bột mì. Sản phẩm Sobia có pH nằm trong khoảng từ 3.37 – 5.53, nồng độ acid lactic từ 0,1 – 0,3% [19].
Vật liệu và phương pháp: Bột Malt (150 – 200g) + bột mì (150 – 200g) → thêm nước (8 – 10 lít) → trộn → lọc qua vải thưa → thêm đường (7 – 10%) → thêm quế và bạch đậu khấu → trộn → lên men ở nhiệt độ ấm (30 – 400C) trong 24 giờ → sản phẩm
Khảo sát sự tác động của nguyên liệu và điều kiện lên men
Khảo sát hàm lượng vi sinh vật hiện diện trong 14 mẫu Sobia cho thấy: Tổng số vi khuẩn hiếu khí từ 4,17 – 8,09 log cfu/ml, trong khi đó vi khuẩn lactic tìm được
từ 4,01 – 8,19 log cfu/ml, Coliform từ 0,67 – 3,84 log cfu/ml, nấm men và mốc
chiếm từ 3,06 – 6,29 log cfu/ml. Trong số 12 vi khuẩn lactic đã được phân lập 86%
là Lactobacillus spp. Gồm 96 thể phân lập và những loài vi khuẩn khác với tỷ lệ xác
Ở tất các mẫu Sobia, pH đều nằm trong khoảng từ 3,37 – 5,53. Nồng độ acid