2.1.1 Đối tượng nghiên cứu
Đối tượng nghiên cứu chúng tơi lựa chọn đĩ là mẫu sinh học mà cụ thể là mẫu máu của người.
Trước hết cần phải hiểu mẫu máu là gì? Trong cơ thể người lượng máu là bao nhiêu? Thành phần của máu gồm cĩ những gì? Chức năng và đặc tính của mẫu máu cĩ đặc điểm gì?
Máu là tổ chức lỏng, lưu thơng trong hệ tuần hồn. Trong 1 kg thể trọng, cĩ 75 - 80ml máu. Trẻ sơ sinh cĩ 100ml máu /kg cân nặng, sau đĩ khối lượng máu giảm dần. Từ 2 - 3 tuổi trở đi khối lượng máu lại tăng dần lên, rồi giảm dần cho đến tuổi trưởng thành thì hằng định. Một người trưởng thành, bình thường máu chiếm 7 - 9% trọng lượng cơ thể. Một người nặng 50kg cĩ khoảng 4 lít máu. Người ta cĩ thể xác định khối lượng máu chính xác bằng nhiều phương pháp khác nhau: Phương pháp tiêm các chất cĩ màu vào máu, chất này ít bị lọc ra khỏi thận, phân huỷ nhanh và khơng độc hại hoặc dùng các chất đồng vị phĩng xạ đánh dấu hồng cầu. Khối lượng máu tăng lên sau khi ăn, uống, khi mang thai, khi truyền dịch... Khối lượng máu giảm khi cơ thể ra nhiều mồ hơi, nơn mửa, ỉa chảy, chấn thương cĩ chảy máu bên trong hoặc bên ngồi cơ thể [17,18]... Nếu khối lượng máu tăng lên trong cơ thể, dịch từ máu sẽ vào khoảng gian bào của da và các mơ, sau đĩ nước được bài xuất dần theo nước tiểu. Nếu khối lượng máu giảm trong cơ thể, dịch từ khoảng gian bào vào máu làm cho khối lượng máu tăng lên. Trong nhiều trường hợp mất máu cấp diễn (mất máu ở các tạng lớn, các xương lớn, mất máu đường động mạch ...) khối lượng máu bị giảm đột ngột, cơ thể khơng cĩ khả năng tự bù trừ; nếu khơng cấp cứu kịp thời, cơ thể sẽ khơng sống được [23,24,25].
Máu gồm hai thành phần: Thể hữu hình (huyết cầu) và huyết tương. Các thể hữu hình của máu là hồng cầu, bạch cầu và tiểu cầu, chiếm 43 - 45% tổng số máu, chỉ số này được gọi là hematocrit. Hồng cầu là thành phần chiếm chủ yếu trong thể hữu hình. Huyết tương chiếm 55 - 57% tổng số máu. Huyết
tương chứa nước, protein, các chất điện giải, các hợp chất hữu cơ và vơ cơ, các hocmon, các vitamin, các chất trung gian hố học, các sản phẩm chuyển hố ... Huyết tương chứa tồn bộ các chất cần thiết cho cơ thể và tồn bộ các chất cần được thải ra ngồi. Huyết tương bị lấy mất fibrinogen thì được gọi là huyết thanh.
Máu cĩ rất nhiều chức năng, dưới đây là những chức năng cơ bản của máu [26]:
Chức năng dinh dưỡng: Máu mang trong mình tồn bộ các chất dinh dưỡng để nuơi cơ thể. Các chất dinh dưỡng được đưa từ ngồi vào qua đường tiêu hố. Ngồi ra bạch cầu cịn vào lịng ống tiêu hố nhận các chất dinh dưỡng theo kiểu "ẩm bào" và "thực bào", rồi lại vào lịng mạch mang thêm một phần các chất dinh dưỡng cho máu.
Chức năng bảo vệ: Máu cĩ khả năng bảo vệ cơ thể khỏi bị nhiễm trùng nhờ cơ chế thực bào, ẩm bào và cơ chế miễn dịch dịch thể, miễn dịch tế bào. Máu cũng cĩ khả năng tham gia vào cơ chế tự cầm máu, tránh mất máu cho cơ thể khi bị tổn thương mạch máu cĩ chảy máu.
Chức năng hơ hấp: Máu mang Oxy từ phổi tới tế bào và mơ, đồng thời máu mang cacbonic từ tế bào và mơ tới phổi.
Chức năng đào thải: Máu mang các chất sau chuyển hố, chất độc, chất lạ tới các cơ quan đào thải (thận, bộ máy tiêu hố, phổi, da) để thải ra ngồi.
Chức năng điều hồ thân nhiệt: Máu mang nhiệt ở phần "lõi" của cơ thể ra ngồi để thải vào mơi trường hoặc giữ nhiệt cho cơ thể nhờ cơ chế co mạch da.
Chức năng điều hồ các chức phận cơ thể: Bằng sự điều hồ tính hằng định nội mơi, máu đã tham gia vào điều hồ tồn bộ các chức phận cơ thể bằng cơ chế thần kinh và thần kinh - thể dịch.
Đặc tính của máu: Máu cĩ tính hằng định. Tính hằng định của máu được đánh giá qua các chỉ số sinh lý, sinh hố của máu. Các chỉ số này, trong điều kiện sinh lý bình thường là rất ít thay đổi hoặc chỉ thay đổi trong một phạm vi rất hẹp. Vì vậy chúng được coi như là một hằng số. Kiểm tra các chỉ số sinh lý, sinh hố của máu là một việc làm vơ cùng quan trọng và rất cần thiết để đánh giá những rối loạn chức năng của cơ thể.
2.1.2 Mục đích nghiên cứu
Xuất phát từ những độc tính của chì và những tác dụng hĩa sinh của nĩ đối với cơ thể con người nên việc xác định hàm lượng chì trong các mẫu sinh học (máu) là rất cần thiết. Do đĩ, trong khuơn khổ của luận văn này chúng tơi nghiên cứu tối ưu hĩa các điều kiện đo, các yếu tố ảnh hưởng để từ đĩ xây dựng được quy trình phân tích xác định được hàm lượng chì trong mẫu máu. Từ đĩ tạo tiền đề cho việc chuẩn đốn cũng như điều trị đối với những người cĩ hàm lượng chì cao trong cơ thể.
2.2 Phương pháp nghiên cứu
Xuất phát từ đối tượng nghiên cứu trong luận văn này là các mẫu sinh học (mẫu máu). Mặt khác, trong cơ thể người bình thường hàm lượng chì trong máu từ 2 – 10 μg/dL. Vì vậy, phương pháp nghiên cứu trong luận văn này chúng tơi sử dụng đĩ là phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử với kỹ thuật nguyên tử hĩa bằng lị Graphit.
2.3 Nội dung nghiên cứu
- Nghiên cứu các điều kiện đo quang phổ hấp thụ nguyên tử của chì. - Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến phép đo quang phổ hấp thụ nguyên tử của chì.
- Nghiên cứu và lựa chọn phương pháp xử lý mẫu máu.
- Xây dựng quy trình phân tích xác định hàm lượng chì trong máu bằng phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử.
- Phân tích, đánh giá hàm lượng chì trong máu của người bình thường và người bị nhiễm độc chì.
- Đánh giá sai số và độ lặp lại của phép đo.
2.4 Nghiên cứu thực nghiệm
2.4.1 Nghiên cứu các điều kiện đo quang phổ hấp thụ của chì 2.4.1.1 Nghiên cứu bước sĩng hấp thụ 2.4.1.1 Nghiên cứu bước sĩng hấp thụ
Mỗi loại nguyên tử của một nguyên tố hĩa học chỉ cĩ thể hấp thụ những bức xạ cĩ bước sĩng mà chính nĩ cĩ thể phát ra trong quá trình phát xạ. Nhưng thực tế khơng phải mỗi loại nguyên tử cĩ thể hấp thụ được tất cả các bức xạ mà
nĩ phát ra, quá trình hấp thụ chỉ tốt và nhạy chủ yếu đối với các vạch nhạy (vạch đặc trưng). Đối với một nguyên tố vạch phổ nào cĩ khả năng hấp thụ càng mạnh thì phép đo đĩ cĩ độ nhạy càng cao.
Đồng thời mỗi vạch phổ cĩ thể cĩ nhiều nguyên tố khác nhau trong mẫu. Những vạch phổ này gần với vạch phổ của nguyên tố phân tích nên chúng cĩ thể chen lấn gây nhiễu tới vạch phổ của nguyên tố phân tích làm cho việc đo cường độ vạch phân tích khĩ khăn và thiếu chính xác.
Vì vậy đặc trưng của các vạch phổ phải thỏa mãn một số điều kiện sau: - Khơng bị các vạch khác chen lấn gây nhiễu hay trùng lặp .
- Cĩ bước sĩng chính xác.
- Cường độ vạch phổ hấp thụ phải phụ thuộc tuyến tính vào nồng độ C trong khoảng nhất định.
Đối với chì cĩ các vạch phổ đặc trưng sau:
Bảng 2.1: Vạch phổ đặc trưng của chì TT Vạch phổ (nm) Độ nhạy (theo thang 10) Tỷ lệ tín hiệu trên nhiễu (S/N) 1 217,0 10,0 1,0 2 283,3 3,9 0,43 3 261,4 0,2 0,35 4 202,2 0,1 1,8
Chì cĩ 4 vạch phổ với độ nhạy và độ nhiễu khác nhau, vạch phổ 217,0(nm) cĩ độ nhạy cao nhất tuy nhiên tỷ lệ tín hiệu trên nhiễu lại lớn hơn so với vạch phổ 283,3(nm). Vạch phổ cĩ tỷ lệ tín hiệu trên nhiễu thấp nhất là vạch phổ 261,4(nm) nhưng vạch phổ này lại cĩ độ nhạy thấp (thấp hơn vạch 217,0 nm đến 50 lần).
2.4.1.2 Nghiên cứu khe đo
Theo nguyên tắc hoạt động của hệ thống đơn sắc trong máy quang phổ hấp thụ nguyên tử, chùm tia phát xạ cộng hưởng của nguyên tố cần nghiên cứu
hướng vào khe đo của máy, được chuẩn trực, phân ly. Sau đĩ chỉ một vạch phổ cần đo được chọn và hướng vào khe đo để tác dụng vào nhân quang điện để phát hiện xác định cường độ của vạch phổ.
Khe đo cĩ ảnh hưởng tới độ nhạy và vùng tuyến tính của phép đo. Để vạch phổ đo khơng bị chen lẫn với các vạch phổ khác khe đo phải khơng được quá rộng. Mặt khác nếu khe đo quá hẹp thì tín hiệu phổ khơng ổn định, độ lặp lại kém.
2.4.1.3 Nghiên cứu nguồn sáng, cường độ đèn catot rỗng
Trong nghiên cứu này chúng tơi sử dụng nguồn sáng là đèn catot rỗng (HCL). Đèn catot rỗng là nguồn bức xạ cộng hưởng. Hoạt động của đèn là sự phát ra tia cĩ bức xạ đặc trưng trong mơi trường khí kém (mơi trường khí Heli). Khi đèn làm việc, catot được nung nĩng đỏ, giữa catot và anot xảy ra sự phĩng điện liên tục, nhờ vậy một số phân tử khí trơ trong đèn bị ion hĩa. Các ion vừa sinh ra sẽ tấn cơng vào catot làm bề mặt catot bị hĩa hơi và trở thành những nguyên từ kim loại tự do. Khi đĩ dưới tác dụng của nhiệt độ trong đèn đang được nung nĩng đỏ, các nguyên tử kim loại này sẽ được kích thích và phát ra phổ phát xạ của nĩ. Đĩ chính là vạch phổ của kim loại làm catot. Chùm tia phát xạ này chính là nguồn tia đơn sắc chiếu qua mơi trường hấp thụ để thực hiện phép đo AAS.
Đèn HCL làm việc tại mỗi chế độ dịng nhất định sẽ cho chùm phát xạ cĩ cường độ nhất định. Cường độ làm việc của đèn HCL cĩ ảnh hưởng tới cường độ hấp thụ của vạch phổ. Dịng điện làm việc đèn HCL của mỗi nguyên tố là khác nhau. Mỗi đèn HCL cĩ dịng giới hạn cực đại Imax được ghi trên vỏ đèn. Theo lý thuyết và thực nghiệm phân tích phổ hấp thụ nguyên tử thì chỉ nên dùng cường độ trong vùng giới hạn từ 60 – 85% dịng cực đại.
2.4.1.4 Nghiên cứu chương trình nhiệt độ của lị Graphit
Nguyên tắc và cách thực hiện của kỹ thuật nguyên tử hĩa bằng là graphit hồn tồn khác với kỹ thuật nguyên tử hĩa trong ngọn lửa. Quá trình nguyên tử hĩa xẩy ra theo 4 giai đoạn kế tiếp nhau, nhiệt độ và thời gian của từng giai đoạn đĩ cĩ vai trị quyết định đến độ nhạy và độ chính xác của phương pháp phân tích.
- Giai đoạn sấy khơ mẫu:
Giai đoạn này đảm bảo cho dung mơi hịa tan mẫu bay hơi hồn tồn mà khơng làm mất mẫu. Nhiệt độ và thời gian sấy khơ mẫu phụ thuộc vào bản chất của các chất ở trong mẫu và dung mơi hịa tan nĩ. Nhiệt độ sấy khơ phù hợp với đa số các mẫu vơ cơ trong mơi trường axit thường từ 100 – 2000C trong thời gian từ 25 – 40s. Với lượng mẫu được bơm vào cuvet 20 μl.
- Giai đoạn tro hĩa luyện mẫu:
Đây là giai đoạn đốt cháy các hợp chất hữu cơ và mùn cĩ trong mẫu sau khi đã sấy khơ, đồng thời cũng nung luyện mẫu ở một nhiệt độ thuận lợi cho giai đoạn nguyên tử hĩa tiếp theo đạt hiệu suất cao, ổn định. Nhiệt độ tro hĩa lớn thì độ nhạy của phép phân tích thấp do nguyên tử bị bay hơi trong quá trình tro hĩa, tuy nhiên khi nhiệt độ tro hĩa luyện mẫu thấp thì quá trình nguyên tử hĩa khơng ổn định.
- Giai đoạn nguyên tử hĩa mẫu:
Đây là giai đoạn cuối cùng của quá trình nguyên tử hĩa mẫu, nhưng lại là giai đoạn quyết định đến cường độ vạch phổ. Song nĩ lại bị ảnh hưởng bởi các giai đoạn trên. Giai đoạn này được thực hiện trong thời gian rất ngắn, thơng thường từ 3 – 6 giây. Nhưng tốc độ tăng nhiệt độ lại rất lớn để đạt ngay tức khắc đến nhiệt độ nguyên tử hĩa và thực hiện phép đo cường độ vạch phổ. Tốc độ tăng nhiệt độ thường là từ 1800 – 25000C/giây, thơng thường sử dụng tốc độ tối đa mà máy cĩ thể cho phép.
Ở giai đoạn này nhiệt độ nguyên tử hĩa của mỗi nguyên tố khác nhau là rất khác nhau. Đồng thời mỗi nguyên tố cũng cĩ một nhiệt độ nguyên tử hĩa giới hạn (Ta) của nĩ. Nhiệt độ Ta này phụ thuộc vào bản chất của mỗi nguyên tố và cũng phụ thuộc trong mức độ nhất định vào trạng thái và thành phần của mẫu mà nĩ tồn tại.
Quá trình nguyên tử hĩa thực hiện trong mơi trường khơng cĩ oxi. Khí trơ thường được dùng làm mơi trường là Ar, He, N2 . Trong mơi trường phân tích khi đo cường độ vạch phổ bắt buộc phải giữ cho tốc độ dẫn khơng đổi hoặc cĩ thể tắt khí mơi trường trong giai đoạn nguyên tử hĩa để đo cường độ vạch phổ. Mơi trường khí trơ thực hiện quá trình nguyên tử hĩa chì là khí Ar.
- Giai đoạn làm sạch cuvet graphit:
Mục đích của quá trình này là loại bỏ các chất cịn lại trong cuvet để thực hiện phép phân tích tiếp theo.
Như vậy quá trình nguyên tử hĩa mẫu trong lị graphit cĩ thể được tĩm tắt như sau [10]:
Hình 2.1: Tĩm tắt chương trình nhiệt độ lị graphit
2.4.2 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến phép đo quang phổ hấp thụ nguyên tử của chì nguyên tử của chì
Do máu cĩ thành phần phức tạp,ngồi các protein cịn cĩ các chất điện giải là các ion kim loại như: Na, K, Ca, Mg… Các nguyên tố này ở hàm lượng lớn sẽ ảnh hưởng đến phép đo phổ hấp thụ nguyên tử của chì, do vậy để khảo sát ảnh hưởng của các nguyên tố trên đến phép đo phổ hấp thụ nguyên tử của chì và tìm các biện pháp khắc phục, loại bỏ các ảnh hưởng đĩ chúng tơi tiến hành sử dụng nồng độ chì là 20μg/l trong nền các nguyên tố Na, K, Ca, Mg cĩ nồng độ như trong máu.
2.5 Nghiên cứu và lựa chọn phương pháp xử lý mẫu máu 2.5.1 Lấy mẫu và bảo quản mẫu 2.5.1 Lấy mẫu và bảo quản mẫu
Máu là tổ chức liên kết đặc biệt, mặt khác do lượng máu thay đổi theo rạng thái sinh lý của cơ thể. Lượng máu tăng sau bữa ăn và khi mang thai, lượng máu giảm khi đĩi và khi cơ thể mất nước. Trạng thái sinh lý bệnh thường cĩ khoảng ½ lượng máu lưu thơng trong mạch, cịn ½ dự trữ trong các kho chứa (trong lách 16%, gan 20% và dưới da 10%). Khối lượng máu giảm đột ngột sẽ gây nguy hiểm đến tính mạng vì làm cho huyết áp giảm nhanh.
Mẫu máu được lấy qua tĩnh mạch vào buổi sáng, cho vào lọ herparin và bảo quản lạnh ở -200C, mẫu bảo quản ở điều kiện này cĩ thể ổn định trong vịng một năm.
2.5.2 Phương pháp xử lý mẫu máu
Hiện nay cĩ rất nhiều phương pháp xử lý mẫu máu để phân tích hàm lượng chì. Phương pháp phổ biến nhất trước đây là phương pháp vơ cơ hĩa ướt, sử dụng hỗn hợp axit HNO3 và HClO4 phương pháp này cĩ nhược điểm là quá trình xử lý mẫu lâu và thường gây ra hiện tượng mất mẫu hoặc nhiễm bẩn trong quá trình xử lý mẫu. Một kỹ thuật xử lý mẫu khác là vơ cơ hĩa trong lị vi sĩng, kỹ thuật này tiết kiệm được thời gian và xử lý mẫu triệt để. Kỹ thuật này thường được áp dụng cho phương pháp phân tích điện hĩa. Kỹ thuật xử lý mẫu mới nhất hiện nay theo, theo Christopher D.Palmer năm 2006 [22] là pha lỗng mẫu trực tiếp trong dung dịch Triton X- 100 0,5% và HNO3 0,2%. Kỹ thuật xử lý mẫu này cĩ ưu điểm là nền Triton X- 100 được loại bỏ khỏi mẫu trong quá trình tro hĩa luyện mẫu. Mặt khác khi cĩ mặt của chất cải biến nền NH4H2PO4
chì sẽ khơng bị mất khi tăng nhiệt độ tro hĩa luyện mẫu và bằng cách này cĩ thể loại trừ được các chất ảnh hưởng dựa vào chương trình nhiệt độ của lị. Chúng tơi áp dụng kỹ thuật xử lý mẫu này để xác định hàm lượng chì trong