Cá thí nghiệm
Cá chẽm dùng trong thí nghiệm (có kích thước 8-11 cm) được sản xuất bằng sinh sản nhân tạo và ương nuôi thành cá giống tại Trung tâm Nghiên cứu Giống và Dịch bệnh Thủy sản –Trường Đại học Nha Trang. Cá khỏe mạnh và đã thích nghi với bể nuôi thí nghiệm từ giai đoạn cá hương cho đến khi bắt đầu sử dụng cho hoạt động nghiên cứu
Chuẩn bị vi khuẩn.
Sau khi được phân lập thuần trên môi trường TSA + 2% NaCl, vi khuẩn được nuôi cấy tăng sinh trong môi trường TSB + 2% NaCl đặt trong tủ ấm lắc đảo (180 rpm) ở nhiệt độ 28-30oC trong 24 h. Tế bào vi khuẩn được thu hoạch bằng cách ly tâm
1000 x g trong 5 phút, rửa 3 lần trong dung dịch nước muối sinh lý. Vi khuẩn sau khi
ly tâm được pha loãng trong nước muối sinh lý tiệt trùng và so sánh độ đục với các ống có độ đục chuẩn (MacFaland) để tạo ra huyền dịch có mật độ vi khuẩn 108 tế bào/ml. Tiến hành pha loãng theo cấp số 10 để tạo ra các dịch huyền phù có mật độ vi khuẩn từ 103-107 tế bào/mL. Mật độ vi khuẩn sống (CFU/mL) của huyền dịch vi khuẩn được xác định bằng phương pháp pha loãng và cấy trang theo phương pháp của Whitman và MacNair (2004) [65].
Gây nhiễm thực nghiệm để xác định độc lực của các chủng vi khuẩn Bacillus sp. Hai chủng vi khuẩn Bacillus sp.(CRB160713 phân lập từ cá chẽm bệnh và
TAOC3 phân lập từ thức ăn) được lựa chọn để tiến hành thí nghiệm cảm nhiễm bằng phương pháp tiêm xoang bụng để xác định liều gây chết 50% (LD50) và thí nghiệm cảm nhiễm bằng phương pháp tiêm cơ xác định liều gây nhiễm 50% ( ID50)
Mỗi thí nghiệm có 6 nghiệm thức gồm 5 nghiệm thức tương ứng với 5 nồng độ vi khuẩn 104, 105, 106, 107, 108 CFU/mL và 1 nghiệm thức đối chứng, mỗi nghiệm thức có 10 cá thể. Vi khuẩn được tiêm với liều lượng 0,2 mL/cá thể, cá đối chứng được
được tiêm 0,2 mL nước muối sinh lý NaCl 0,85 % tiệt trùng.
Trước khi cảm nhiễm, ngừng cho cá ăn trong 24 h. Cá thí nghiệm được bắt từ bể nuôi bằng vợt và gây mê bằng dung dịch Ethyleneglycol monophenylether 100 ppm. Sau khi tiêm vi khuẩn, cá được nuôi riêng trong các bể composite 200 L có chứa nước mặn 25-30 ‰, được sục khí liên tục 24/24h và duy trì nhiệt độ nước ổn định từ 28- 29oC bằng máy điều hòa không khí. Trong thời gian thí nghiệm, mỗi ngày cho cá ăn thức ăn viên, lượng thức ăn theo nhu cầu và hoạt động bắt mồi của cá, thay 50% lượng nước trong bể.
Quan sát, ghi nhận mọi biểu hiện bất thường của cá thí nghiệm và số lượng cá chết, cá bị lở loét sau khi gây nhiễm cho đến khi thí nghiệm kết thúc.
Thí nghiệm kết thúc sau 14 ngày tính từ ngày không phát hiện thêm cá bị lở loét. Cá chết và cá bị lở loét được giải phẫu lấy não và gan, thận và cơ cấy trên môi trường TSA bổ sung 2% NaCl.