Để thực hiện các nội dung trong luận văn, một số phương pháp nghiên cứu bệnh ở động vật thủy sản được thực hiện:
- Phương pháp phân lập vi khuẩn ở cá bệnh
- Phương pháp cấy hộp trải xác định vi khuẩn trong thực phẩm - Phương pháp xác định độc lực.
- Phương pháp nghiên cứu mô bệnh học - Phương pháp nhuộm Gram trên lát cắt mô
- Phương pháp xác định độ nhạy kháng sinh của vi khuẩn 2.2.3.1. Phương pháp kiểm tra các tác nhân gây bệnh
Quan sát, ghi nhận các dấu hiệu bệnh lý bên ngoài,
Kiểm tra ký sinh trùng ngoại và nội ký sinh theo phương pháp của Bùi Quang Tề (2006) [6] để xác định sự hiện diện của ký sinh trùng trên cơ thể cá.
Kiểm tra virus gây bệnh Viral Nervous Necrosis và Irido virus bằng kit kiểm tra nhanh VNN, GIV của Rega Bio (Đài Loan).
Phương pháp phân lập vi khuẩn ở cá bệnh
Phương pháp phân lập vi khuẩn ở cá xương được trình bày bởi Whitman và MacNair (2004) [65] được dùng để phân lập vi khuẩn.
Mẫu bệnh phẩm từ gan, thận, não và cơ cá được cấy trên môi trường TSA (Merck) có bổ sung 2% NaCl, TCBS (Merck) và KF (Merck) + 2% NaCl. Các hộp lồng sau khi cấy được ủ ở nhiệt độ 28-30oC, quan sát sự xuất hiện vi khuẩn của các đĩa nuôi cấy 2 lần/ngày. Các chủng vi khuẩn thu được sau đó được nuôi cấy thuần bằng cách thu khuẩn lạc rời cấy chuyền nhiều lần trên môi trường TSA + 2% NaCl.
2.2.3.2. Phương pháp phân lập vi khuẩn trong thức ăn
Sự hiện diện của vi khuẩn trong mỗi mẫu thức ăn được xác định thông qua phương pháp của Trần Linh Thước (2007) [8].
0,5 g thức ăn ở mỗi mẫu được cân và đưa vào túi nhựa vô khuẩn và nghiền nhỏ bằng dụng cụ thủy tinh đã được vô trùng. Mẫu thức ăn đã nghiền nhỏ sau đó được đưa vào ống falcon 15mL vô trùng và bổ sung thêm 0,5 mL nước muối sinh lý tiệt trùng. Hỗn hợp được trộn đều bằng máy votex trong 1-5 phút. Tiến hành pha loãng bằng nước muối sinh lý tạo ra các huyền dịch có độ pha loãng 10-1 và 10-2 so với huyền dịch gốc. Tại mỗi nồng độ, 100 µL huyền dịch thức ăn được cấy trang trên môi trường TSA + 2% NaCl. Các đĩa nuôi cấy được ủ ở 28-30oC, lặp lại 2 lần.
Quan sát sự hiện diện của vi khuẩn sau 24-48 h nuôi cấy, xác định vi khuẩn tổng
số và vi khuẩn Bacillus tổng số. Vi khuẩn thuộc Bacillus được xác định thông qua các
đặc điểm: khuẩn lạc màu trắng đục, bề mặt thô ráp trên mỗi đĩa, kết quả dương tính khi nhuộm Gram và kiểm tra phản ứng catalase, hình thành bào tử trong điều kiện hiếu khí.
Các chủng vi khuẩn Bacillus thuần được nuôi tăng sinh, sau đó được lưu giữ
trong môi trường TSB + 2 % NaCl bổ sung 20% Glycerol ở -80oC.
2.2.3.3. Phương pháp định danh vi khuẩn
Đặc điểm hình thái, khả năng di động, đặc điểm về nhuộm Gram và khả năng sinh bào tử của chủng vi khuẩn được xác định thông qua quan sát các tiêu bản ép tươi, tiêu bản nhuộm Gram (theo Hucker & Conn, 1923 có cải tiến) [40], tiêu bản nhuộm bào tử (theo Schaeffer and Fulton 1933) [55]. Khả năng sinh trưởng ở các nhiệt độ khác nhau và nồng độ muối khác nhau được thực hiện trên môi trường TSB, khả năng sinh trưởng dưới điều kiện yếm khí được thực hiện trên môi trường TSA +2% NaCl.
Một số đặc điểm sinh hóa của chủng vi khuẩn được thực hiện trên kit API 20E (bioMerieux®, France) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Phản ứng oxidase được thực
hiện bằng sản phẩm Microbiology Bactident® Oxidase (Merck). Các phản ứng sinh hóa truyền thống khác như catalase, khả năng thủy phân tinh bột được tiến hành theo phương pháp của MacFaddin (1980) [49], khả năng thủy phân casein được tiến hành theo phương pháp của Logan và De Vos (2009) [48].
Định danh vi khuẩn được thực hiện theo khóa phân loại của Gordon (1989) [37] kết hợp so sánh các đặc điểm sinh hóa của chủng vi khuẩn với đặc điểm sinh hóa của
các chủng Bacillus của Bergey [48] và trong các nghiên cứu khác. Bên cạnh đó, một
vài chủng vi khuẩn đã được định danh bằng phương pháp sinh hóa cũng được gửi đến phòng thí nghiệm công ty Nam Khoa để định danh bằng phương pháp giải trình tự gen 16S rDNA (16S rDNA sequencing).
Phương pháp xác định khả năng sinh bào tử của vi khuẩn
Phương pháp nhuộm bào tử của Schaeffer and Fulton (1933) [55] có cải tiến được sử dụng để xác định khả năng sinh bào tử của vi khuẩn.
Quy trình nhuộm như sau:
Bước 1: Vi khuẩn nuôi cấy trên TSA +2% NaCl sau 72 h được dùng để tạo các tiêu bản vi khuẩn phết. Các tiêu bản được để khô tự nhiên và cố định trên ngon lửa đèn cồn.
Bước 2: Nhuộm với dịch malachite green bão hòa (5-7%) trong 15-20 phút. Bước 3: Rửa tiêu bản nhuộm dưới vòi nước chảy.
Bước 4: Nhuộm với Fucshin trong 30 giây.
Bước 5: Rửa tiêu bản, để khô, quan sát dưới kính hiển vi. Vi khuẩn bắt màu hồng đỏ của Fucshin, bào tử bắt màu xanh của malachite green.
2.2.3.4. Phương pháp xác định độc lực
Cá thí nghiệm
Cá chẽm dùng trong thí nghiệm (có kích thước 8-11 cm) được sản xuất bằng sinh sản nhân tạo và ương nuôi thành cá giống tại Trung tâm Nghiên cứu Giống và Dịch bệnh Thủy sản –Trường Đại học Nha Trang. Cá khỏe mạnh và đã thích nghi với bể nuôi thí nghiệm từ giai đoạn cá hương cho đến khi bắt đầu sử dụng cho hoạt động nghiên cứu
Chuẩn bị vi khuẩn.
Sau khi được phân lập thuần trên môi trường TSA + 2% NaCl, vi khuẩn được nuôi cấy tăng sinh trong môi trường TSB + 2% NaCl đặt trong tủ ấm lắc đảo (180 rpm) ở nhiệt độ 28-30oC trong 24 h. Tế bào vi khuẩn được thu hoạch bằng cách ly tâm
1000 x g trong 5 phút, rửa 3 lần trong dung dịch nước muối sinh lý. Vi khuẩn sau khi
ly tâm được pha loãng trong nước muối sinh lý tiệt trùng và so sánh độ đục với các ống có độ đục chuẩn (MacFaland) để tạo ra huyền dịch có mật độ vi khuẩn 108 tế bào/ml. Tiến hành pha loãng theo cấp số 10 để tạo ra các dịch huyền phù có mật độ vi khuẩn từ 103-107 tế bào/mL. Mật độ vi khuẩn sống (CFU/mL) của huyền dịch vi khuẩn được xác định bằng phương pháp pha loãng và cấy trang theo phương pháp của Whitman và MacNair (2004) [65].
Gây nhiễm thực nghiệm để xác định độc lực của các chủng vi khuẩn Bacillus sp. Hai chủng vi khuẩn Bacillus sp.(CRB160713 phân lập từ cá chẽm bệnh và
TAOC3 phân lập từ thức ăn) được lựa chọn để tiến hành thí nghiệm cảm nhiễm bằng phương pháp tiêm xoang bụng để xác định liều gây chết 50% (LD50) và thí nghiệm cảm nhiễm bằng phương pháp tiêm cơ xác định liều gây nhiễm 50% ( ID50)
Mỗi thí nghiệm có 6 nghiệm thức gồm 5 nghiệm thức tương ứng với 5 nồng độ vi khuẩn 104, 105, 106, 107, 108 CFU/mL và 1 nghiệm thức đối chứng, mỗi nghiệm thức có 10 cá thể. Vi khuẩn được tiêm với liều lượng 0,2 mL/cá thể, cá đối chứng được
được tiêm 0,2 mL nước muối sinh lý NaCl 0,85 % tiệt trùng.
Trước khi cảm nhiễm, ngừng cho cá ăn trong 24 h. Cá thí nghiệm được bắt từ bể nuôi bằng vợt và gây mê bằng dung dịch Ethyleneglycol monophenylether 100 ppm. Sau khi tiêm vi khuẩn, cá được nuôi riêng trong các bể composite 200 L có chứa nước mặn 25-30 ‰, được sục khí liên tục 24/24h và duy trì nhiệt độ nước ổn định từ 28- 29oC bằng máy điều hòa không khí. Trong thời gian thí nghiệm, mỗi ngày cho cá ăn thức ăn viên, lượng thức ăn theo nhu cầu và hoạt động bắt mồi của cá, thay 50% lượng nước trong bể.
Quan sát, ghi nhận mọi biểu hiện bất thường của cá thí nghiệm và số lượng cá chết, cá bị lở loét sau khi gây nhiễm cho đến khi thí nghiệm kết thúc.
Thí nghiệm kết thúc sau 14 ngày tính từ ngày không phát hiện thêm cá bị lở loét. Cá chết và cá bị lở loét được giải phẫu lấy não và gan, thận và cơ cấy trên môi trường TSA bổ sung 2% NaCl.
2.2.3.5. Phương pháp nghiên cứu mô bệnh học
Tiến hành thu và cố định trong dung dịch đệm Formalin 10% các mẫu gan, thận, não, lách, cơ của 8 cá hấp hối (4 cá từ thí nghiệm tiêm xoang bụng; 4 cá từ thí nghiệm tiêm cơ); 4 cá sống sót sau khi kết thúc thí nghiệm tiêm xoang bụng và 2 cá đối chứng.
Quy trình tạo các lát cắt mô học tiến hành theo phương pháp nghiên cứu mô học trên cá xương của Tonguthai và CTV. (1999) [61].
Để nghiên cứu các biến đổi bệnh lý trong mô và tế bào các tổ chức cá bệnh, các lát cắt được nhuộm bằng Hematoxylin & Eosin.
Để quan sát sự xuất hiện của vi khuẩn trong các tổ chức mô, một số lát cắt được nhuộm theo quy trình nhuộm Gram trên lát cắt mô học của Engbaek và CTV. (1979) [29].
Hình 2.2: Quy trình nghiên cứu mô bệnh học. 2.2.3.6. Phương pháp xác định độ nhạy của vi khuẩn với kháng sinh
Tính nhạy của vi khuẩn với các loại thuốc kháng sinh được xác định theo phương pháp khuyếch tán trên đĩa thạch trên môi trường MHA (Muller-Hintol Agar) của Whitman và MacNair (2004) [65].
Các đĩa kháng sinh được sử dụng bao gồm gentamicin (10 µg); nalidicid acid (30 µg); cefalexin (30 µg); amoxycillin (25 µg); norfloxacine (5 µg); tetracycline (30 µg);
Thu mẫu cá chẽm từ thí nghiệm cảm nhiễm Cố định mẫu trong đệm formalin 10% Tạo các lát cắt 5-7 µm bằng máy Microtone. Thấm parafin và đúc mẫu. Làm mất nước và mềm mẫu Đọc tiêu bản dưới kính hiển vi quang học Gắn tiêu bản bằng bom- canada Nhuộm H&E; nhuộmGram
doxycycline (30 µg); ciprofloxacin (5 µg); clindamycin (2 µg); streptomycin (10 µg); rifampin (30 µg); erythromycin (15 µg).
2.2.4 Xử lý số liệu
Số liệu thu được từ các thí nghiệm được xử lý theo thống kê, sử dụng các phần mềm Microsolft Excel và SPSS. Liều gây chết 50 % (LD50) và liều gây nhiễm 50 % (ID50) được xác định bằng probit analysis trên SPSS 15.0.
Chương III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1.Kết quả nghiên cứu
3.1.1. Kết quả phân lập vi khuẩn Bacillus sp.
3.1.1.1. Kết quả phân lập vi khuẩn Bacillus sp. từ cá chẽm bệnh.
Trong thời gian nghiên cứu, 9 mẫu cá chẽm bệnh biểu hiện dấu hiệu bệnh lý rõ ràng ở các địa điểm nuôi thuộc Khánh Hòa đã được thu và kiểm tra (bảng 3.1). Kết quả kiểm tra cho thấy sự xuất hiện của tác nhân vi khuẩn ở tất cả các mẫu kiểm tra, ký
sinh trùng và vi rút xuất hiện tần số thấp. Vibrio là nhóm vi khuẩn xuất hiện ở hầu hết
các mẫu kiểm tra. Tuy nhiên bên cạnh hai nhóm tác nhân đã được thông báo gây bệnh
trên cá chẽm trong những nghiên cứu trước đây là Vibrio và Streptococcus, kết quả nghiên cứu cũng đã tìm thấy 2 chủng vi khuẩn Bacillus sp. khi phân lập trên môi
trường TSA + 2 % NaCl.
Các mẫu cá phân lập được vi khuẩn Bacillus sp. thường biểu hiện các dấu hiệu
bệnh lý như đen thân, rụng vẩy, hoại tử và xuất huyết nhẹ vùng cơ dưới da, lở loét thân
và xuất huyết nội quan (hình 3.1). Cá nhiễm vi khuẩn Bacillus cũng có thể nhiễm vi khuẩn Vibrio hay cho kết quả dương tính với tác nhân vi rút và ký sinh trùng.
Hình 3.1: Dấu hiệu bệnh lý lở loét cơ (a) và xuất huyết gan (b) của cá chẽm bệnh nuôi ở khu vực Khánh Hòa.
Bảng 3.1: Kết quả xét nghiệm tác nhân gây bệnh trên các mẫu cá chẽm nuôi thương phẩm ở Khánh Hòa từ tháng 6/2013 đến 5/2014.
Kết quả phân lập vi khuẩn Vi rút
Vibrio Bacillus S. iniae
Ngày Nguồn mẫu Số cá thể Kích cỡ cá (cm) Dấu hiệu bệnh lý đặc trưng G T N G T N G T N NNV GIV Ký sinh trùng Ký hiệu chủng 17/6/2013 Cam Ranh 5 12,44 ± 0,70 Rụng vẩy, mòn vây, hoại tử, lở loét cơ
dưới da
1 2 4 1 4 (*) CRB160713
27/6/2013 Ninh Hòa 4 6,63 ± 0,94 Xơ vây, lở loét 2 2 2 1 (*)
25/7/2014 Ninh Hoà 4 23,55 ± 4,12 Mù mắt, xơ vây, lở
loét 2 2 2 (**)
16/8/2014 Ninh Hòa 2 6,57 ± 0,76 Xơ vây, lở loét 2 2 2
4/10/2013 Ninh Hòa 4 11,45 ± 0,82 Xơ vây, cụt đuôi 3 3 1
2/3/2014 Vạn Ninh 3 41,5 ± 3,04 Rụng vẩy, đục cơ,
gan teo và xuất huyết 2 2 2 VNB020314
18/4/2014 Ninh Hòa 4 6,375 ± 1,25
Xơ vây, đục mắt, xuất huyết lở loét
thân
3 4 1 2 2 2
15/5/2014 Ninh Hòa 8 8,03 ± 0,54 Đục mắt, xơ vây, xuất
huyết gan 2 2 2 2 2 2 1 2
20/5/2014 Ninh Hòa 6 7,53 ± 0,83 Đục mắt, xơ vây, xuất
huyết vây, lở loét 4 4 1 1 1 1 1
Ghi chú * Trùng bánh xe ký sinh trên mang cường độ 20-30/ cung mang; ** Benedia ký sinh trên da cường độ 6-15 con/ cá thể.
G, T, N là viết tắt của gan, thận, não
3.1.1.2. Kết quả phân lập vi khuẩn Bacillus sp. từ thức ăn.
Từ kết quả phân lập vi khuẩn trên cá chẽm bệnh nuôi ở Vạn Ninh, thức ăn công nghiệp dạng viên đã được sử dụng cho các đàn cá chẽm bệnh còn lưu mẫu tại cơ sở nuôi được gửi mẫu về phòng thí nghiệm để kiểm tra chỉ tiêu vi khuẩn.
Trong tổng số 17 mẫu thức ăn được kiểm tra trong 3 đợt, 15 mẫu (88%) có sự
hiện diện của vi khuẩn trong đó 8 mẫu (47%) bắt gặp chủng vi khuẩn Bacilus sp. Mật độ vi khuẩn tổng số và mật độ vi khuẩn Bacillus sp. trong các mẫu thức ăn được thể
hiện tại bảng 3.2.
Bảng 3.2: Kết quả phân lập và định lượng vi khuẩn từ thức ăn viên dùng cho cá chẽm. Kết quả phân lập vi khuẩn
(CFU/g) Ngày gửi Ký hiệu
mẫu Cỡ thức ăn (mm ) Bacillus sp. Khác Ký hiệu chủng Bacillus sp. OC3 3 4 x 102 1,24 x 105 TAOC3 OC5 5 1,61 x105 OC7 7 1,93 x 105 OC10 10 102 8,15 x 104 TAOC10 3/3/2014 OC13 13 102 5,60 x 104 TAOC13 OC1120214 1 OC1051013 1 OC2020314 2 1,30 x 103 OC3240514 3 102 1,25 x 104 TAOC32 OC7150114 7 102 1,05 x 104 TAOC72 14/3/2014 OC10090214 10 9,50 x 103 OC2250714 2 7,15 x 103 OC3240514 3 2 x 102 1,33 x 103 TAOC33 OC5160714 5 1,53 x 103 OC7170714 7 1,41 x 103 OC10090814 10 4 x 103 1,56 x 103 TAOC103 15/5/2014 OC13240714 13 4 x 103 8,05 x 103 TAOC133
3.1.2. Đặc điểm và kết quả định danh các chủng vi khuẩn Bacillus sp.
Các chủng vi khuẩn Bacillus sp. phân lập từ cá bệnh và thức ăn công nghiệp có
đặc điểm Gram (+), hình que (hình 3.2 c); có xu hướng hình thành chuỗi và sinh bào tử hình ellip nằm ở trung tâm tế bào khi nuôi cấy dài ngày (hình 3.2 d). Vi khuẩn sinh trưởng tốt trên môi trường TSA, BA, TSB ở 28-30oC. Khi nuôi cấy trong môi trường TSA, khuẩn lạc có màu trắng sữa đục, bề mặt thô ráp như bông, mép nhăn, đường kính 2-3 mm sau 24 h nuôi cấy; có lõi và đường kính 3-4 mm sau 48 h nuôi cấy (hình 3.2 a). Trên môi trường BA bổ sung 5% máu cừu cho phản ứng dung huyết β (hình 3.2 b)
Hình 3.2: Đặc điểm về hình thái của các chủng vi khuẩn Bacillus sp. đã phân lập
được: khuẩn lạc trên TSA+ 2% NaCl (a) và trên BA + 5% máu cừu (b); tế bào vi khuẩn nhuộm Gram (c) và nhuộm bào tử (d).
a b
c d
10µm 10µm
Bảng 3.3 : Một số đặc điểm về hình thái, sinh lý, sinh hóa của chủng vi khuẩn
Bacillus sp. phân lập từ cá chẽm bệnh và thức ăn.
Đặc điểm CR B170613 VN B120314 TA OC3 TA OC10 TA OC13 TA OC32 TA OC72 TA OC33 TA OC103 TA OC133 Bergey Gram + + + + + + + + + + + Hình thành chuỗi tế bào + + + + + + + + + + + Di động + + + + + + + + + + +
Chiều dài tế bào > 3µm + + + + + + + + + + +
Bào tử ellip + + + + + + + + + + +
Bào tử ở trung tâm hay gần trung tâm + + + + + + + + + +
Thể bào tử phình to - - - -
Khuẩn lạc hình thành chân giả - - - -
Dung huyết trên 5% máu cừu β β Β β Β β β β β β β
Sinh trưởng ở 50ºC - - -
Sinh trưởng kị khí + + + + + + + + + + +
10% NaCl - - - + - - -
Sinh trưởng 7% NaCl + + + + + + + + + + +
Catalase + + + + + + + + + + + Glucose + + + + + + + + + + + Sorbitol - - - - Mannitol - - - - Inositol - - - - Melibiose - - - - Sinh acid trong môi trường: Arabitose - - - - β-Galactosidase - - - - Lysine decarboxylase - - - - Arginine dihydrolase + + + + + + + + + + d Ornithine dehydroxylase - - - - Sử dụng citrate - - - + Urease - - - d Indole - - - Voges- Proskauer + + + + + + + + + + + Khử nitrate + + + - + - + - + + d
Thủy phân casein + + + + + + + + + + +
Thủy phân tinh bột + + + - + + + + + + +
Oxidase - - - -
Kết quả xác định các đặc điểm sinh lý sinh hóa chủng vi khuẩn Bacillus sp. cho