d. Sự thủy phân các phế liệu cá bằng các enzyme protease thương mại và các
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1. Sơ đồ nghiên cứu tổng quát
Quá trình nghiên cứu có thể được tổng quát theo sơ đồ Hình 2.1.
Hình 2.1. Sơ đồ nghiên cứu tổng quát
2.2.2. Phân tích các thành phần hóa học cơ bản trong đầu cá ngừ vây vàng
Đầu cá ngừ vây vàng được xác định các thành phần hóa học sau:
1. Xác định độ ẩm theo phương pháp chuẩn AOAC 950.46 (2000) [31].
2. Xác định hàm lượng tro theo phương pháp chuẩn AOAC 923.03 (2000) [31]. Nghiên cứu xác định các thông số thích hợp cho quá trình thủy phân thu hồi lipid (tỷ lệ nước so với nguyên liệu, tỷ lệ enzyme so với nguyên liệu, nhiệt độ thủy phân, thời gian thủy phân) đối với từng loại enzyme (Alcalase, Protamex, Flavourzyme) bằng phương pháp thăm dò cổ điển.
Sản xuất dầu theo các thông số thích hợp đã xác định được đối với từng loại enzyme. So sánh hiệu suất thu hồi lipid và chất lượng dầu thu được từ quá trình thủy phân bằng 3 loại enzyme trên. Lựa chọn loại enzyme
hiệu quả nhất.
Sản xuất dầu theo các thông số tối ưu đã xác định được và đánh giá chất lượng của dầu thô thành phẩm thu được.
Xác định các thành phần hóa học cơ bản của đầu cá ngừ vây vàng.
Tối ưu hóa các thông số của chế độ thủy phân sử dụng enzyme đã chọn bằng phương pháp quy hoạch thực nghiệm.
3. Xác định hàm lượng đạm tổng số theo phương pháp chuẩn AOAC 987.04 (2000) [31].
(Hàm lượng protein = 6,25 x Hàm lượng đạm tổng số)
4. Xác định hàm lượng lipid tổng số theo phương pháp Folch (1957) [52].
2.2.3. Quy trình dự kiến thu hồi dầu thô từ đầu cá ngừ vây vàng theo phương pháp thủy phân bằng enzyme pháp thủy phân bằng enzyme
Sơ đồ quy trình thu hồi dầu thô từ đầu cá ngừ vây vàng theo phương pháp thủy phân bằng enzyme được thể hiện trong Hình 2.2.
Hình 2.2. Sơ đồ quy trình dự kiến thu hồi dầu thô từ đầu cá ngừ vây vàng bằng phương pháp thủy phân
Xay nhỏ
Thủy phân
Tỷ lệ nước so với nguyên liệu Tỷ lệ enzyme so với nguyên liệu Nhiệt độ thủy phân
Thời gian thủy phân pH môi trường Lọc Dịch đạm thủy phân Cặn ly tâm Bất hoạt enzyme Ly tâm Xương Rửa sạch Dầu cá Đầu cá ngừ vây vàng Dịch lọc Nhũ tương
Thuyết minh quy trình:
1. Nguyên liệu – Rửa:
Nguyên liệu là các loài cá hoặc phế liệu cá đảm bảo tươi tốt, nguyên liệu có thể được qua bảo quản lạnh, bảo quản đông. Nguyên liệu phải được rửa sạch tạp chất, cát sạn.
2. Xay nhỏ:
Mục đích của xay nhỏ là:
- Phá vỡ kết cấu tế bào, giúp cho lipid tự do nằm trong các tế bào và mô dễ dàng thoát ra ngoài.
- Tế bào bị phá vỡ làm tăng diện tích tiếp xúc của nguyên liệu với enzyme để rút ngắn thời gian thủy phân và quá trình thủy phân được triệt để hơn.
Quá trình xay nhỏ được thực hiện trên máy xay trục vít có đường kính mắt sàng d = 3 – 4 mm.
3. Thủy phân:
Sử dụng một số enzyme protease thương mại như Protamex, Alcalase, Flavourzyme… để thực hiện sự thủy phân. Đây là công đoạn chính quan trọng nhất trong quá trình tách dầu. Trong quá trình thủy phân, ngoài việc protein bị thủy phân thành axit amin và peptide nhờ enzyme protease thì quá trình thủy phân còn làm phá vỡ tế bào mô mỡ giúp giải phóng dầu (Dumay và cộng sự, 2006) [47]. Đồng thời, sự tác động của enzyme protease vào protein làm yếu liên kết giữa protein – lipid, tạo điều kiện giúp lipid liên kết giải phóng ra ngoài.
Thao tác thủy phân tiến hành như sau: Thịt cá đã nghiền nhỏ có thể trộn với một lượng nước cất nhất định, hỗn hợp được đun nóng đến khi đạt nhiệt độ nhất định. Bổ sung enzyme với tỷ lệ phù hợp, giữ ổn định nhiệt độ trong suốt quá trình thủy phân, cần khuấy đảo để tăng cường quá trình thủy phân.
4. Bất hoạt enzyme:
Để kết thúc quá trình thủy phân, enzyme được bất hoạt bằng cách nâng nhiệt hỗn
hợp thủy phân lên 900C trong 15 phút (Guerard và cộng sự, 2002; Liaset và cộng sự,
2003; Ovissipour và cộng sự, 2009) [56], [67], [80]. Việc nâng nhiệt còn giúp tiêu diệt vi sinh vật có hại, giảm độ nhớt của khối hỗn hợp thủy phân, tạo điều kiện cho quá trình phân ly được dễ dàng hơn.
5. Lọc:
Hỗn hợp sau thủy phân đem lọc qua rây để tách xương và phần dịch lọc.
6. Ly tâm:
Dịch lọc được đem ly tâm. Sau khi ly tâm, sản phẩm thu được gồm 4 phần: phần dầu ở lớp trên cùng, một ít nhũ tương, dịch đạm thủy phân ở giữa và phần cặn ly tâm (chứa protein chưa thủy phân, peptide không tan…) ở dưới cùng. Tiến hành thu hồi
dầu rồi đem đi bảo quản ở nhiệt độ -18 đến -200C.
2.2.4. Bố trí thí nghiệm xác định các thông số thích hợp cho quá trình thủy phân thu hồi lipid từ đầu cá ngừ vây vàng bằng 3 loại enzyme theo phương pháp phân thu hồi lipid từ đầu cá ngừ vây vàng bằng 3 loại enzyme theo phương pháp thăm dò cổ điển
Quá trình thủy phân được thực hiện với pH cố định là giá trị pH tự nhiên của nguyên liệu với lý do đã được trình bày trong mục 2.1.2. Trên cơ sở tham khảo một số công trình nghiên cứu trước đây, 4 thông số ảnh hưởng đến hiệu suất thu hồi dầu và chất lượng dầu cần nghiên cứu là:
- Tỷ lệ nước so với nguyên liệu - Tỷ lệ enzyme so với nguyên liệu - Nhiệt độ thủy phân
- Thời gian thủy phân.
Việc lựa chọn các thông số thích hợp cho quá trình thủy phân thu hồi lipid dựa vào 3 chỉ tiêu: hiệu suất thu hồi lipid, chỉ số axit và chỉ số peroxyt của dầu thu được. Chỉ số axit và chỉ số peroxyt lần lượt thể hiện mức độ thủy phân và oxy hóa của dầu.
2.2.4.1. Bố trí thí nghiệm xác định các thông số thích hợp cho quá trình thủy phân thu hồi lipid từ đầu cá ngừ vây vàng bằng enzyme Protamex theo phương phân thu hồi lipid từ đầu cá ngừ vây vàng bằng enzyme Protamex theo phương pháp thăm dò cổ điển
a. Bố trí thí nghiệm xác định tỷ lệ nước so với nguyên liệu thích hợp cho quá trình thủy phân thu hồi lipid từ đầu cá ngừ vây vàng bằng enzyme Protamex trình thủy phân thu hồi lipid từ đầu cá ngừ vây vàng bằng enzyme Protamex
Hình 2.3. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định tỷ lệ nước so với nguyên liệu thích hợp cho quá trình thủy phân thu hồi lipid từ đầu cá ngừ vây vàng bằng Protamex
Đầu cá ngừ vây vàng đã được nghiền nhỏ đông lạnh được đem rã đông rồi tiến hành thủy phân 5 mẫu với các thông số cố định là: tỷ lệ enzyme Protamex so với
nguyên liệu là 0,5%, pH tự nhiên của nguyên liệu, nhiệt độ thủy phân 50 + 0,50C với
Nhũ tương
Tỷ lệ Protamex so với NL: 0,5% pH tự nhiên của nguyên liệu
Nhiệt độ thủy phân: 50 + 0,50C
Thời gian thủy phân: 2 giờ Đầu cá ngừ đã nghiền nhỏ đông lạnh
Rã đông
Thủy phân với tỷ lệ nước khác nhau (%)
Lọc
Bất hoạt enzyme
Dịch đạm thủy phân Ly tâm
Xác định hiệu suất thu hồi lipid. Xác định chỉ số axit, chỉ số peroxyt
Chọn tỷ lệ nước so với nguyên liệu thích hợp Cặn Xương 100 75 50 25 Dầu cá 0 Dịch lọc
thời gian thủy phân là 2 giờ. Tỷ lệ nước so với nguyên liệu ở 5 mẫu là 0%, 25%, 50%,
75% và 100%. Sau khi thủy phân, nâng nhiệt độ lên 900C trong 15 phút để bất hoạt
enzyme, sau đó lọc qua rây để tách xương rồi đem dịch lọc ly tâm với tốc độ 10.000
vòng/phút ở 40C trong 30 phút. Sau khi ly tâm, thu hồi dầu ở lớp trên cùng và tiến
hành xác định hiệu suất thu hồi lipid, chỉ số axit và chỉ số peroxyt của dầu thu được. Dựa vào hiệu suất thu hồi lipid và hai chỉ số chất lượng này, ta chọn được tỷ lệ nước thích hợp nhất cho quá trình thủy phân thu hồi dầu từ đầu cá ngừ vây vàng bằng enzyme Protamex.
b. Bố trí thí nghiệm xác định tỷ lệ enzyme Protamex so với nguyên liệu thích hợp cho quá trình thủy phân thu hồi lipid từ đầu cá ngừ vây vàng hợp cho quá trình thủy phân thu hồi lipid từ đầu cá ngừ vây vàng
Đầu cá ngừ vây vàng đã được nghiền nhỏ đông lạnh được đem rã đông rồi tiến hành thủy phân 5 mẫu với các thông số cố định là: tỷ lệ nước thích hợp đã chọn từ thí
nghiệm a, pH tự nhiên của nguyên liệu, nhiệt độ 50 + 0,50C với thời gian thủy phân là
2 giờ. Tỷ lệ enzyme Protamex so với nguyên liệu ở 5 mẫu là 0,1%, 0,3%, 0,5%, 0,7%
và 0,9% (w/w). Sau khi thủy phân, nâng nhiệt độ lên 900C trong 15 phút để bất hoạt
enzyme, sau đó lọc qua rây để tách xương rồi đem ly tâm với tốc độ 10.000 vòng/phút
ở nhiệt độ 40C trong 30 phút. Sau khi ly tâm, thu hồi dầu ở lớp trên cùng rồi tiến hành
xác định hiệu suất thu hồi lipid, chỉ số axit và chỉ số peroxyt của dầu thu được. Dựa vào hiệu suất thu hồi lipid và hai chỉ số chất lượng, ta chọn được tỷ lệ enzyme Protamex thích hợp cho quá trình thủy phân.
Hình 2.4. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định tỷ lệ enzyme Protamex so với nguyên liệu thích hợp cho quá trình thủy phân thu hồi lipid
c. Bố trí thí nghiệm xác định nhiệt độ thủy phân thích hợp để thu hồi lipid từ đầu cá ngừ vây vàng bằng enzyme Protamex
Sơ đồ bố trí thí nghiệm được thể hiện trong Hình 2.5.
Nhũ tương
Tỷ lệ nước so với NL thích hợp pH tự nhiên của nguyên liệu
Nhiệt độ thuỷ phân: 50 + 0,50C
Thời gian thủy phân: 2 giờ Đầu cá ngừ đã nghiền nhỏ đông lạnh
Rã đông
Thủy phân với tỷ lệ enzyme Protamex khác nhau (%)
Lọc
Bất hoạt enzyme
Dịch đạm thủy phân Ly tâm
Xác định hiệu suất thu hồi lipid. Xác định chỉ số axit, chỉ số peroxyt
Chọn tỷ lệ enzyme Protamex so với nguyên liệu thích hợp Cặn Xương 0,9 0,7 0,5 0,3 Dầu cá 0,1 Dịch lọc
Hình 2.5. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định nhiệt độ thủy phân thích hợp để thu hồi lipid từ đầu cá ngừ vây vàng bằng enzyme Protamex
Đầu cá ngừ vây vàng đã được nghiền nhỏ đông lạnh được đem rã đông rồi tiến hành thủy phân 4 mẫu với các thông số cố định là: tỷ lệ nước và tỷ lệ enzyme Protamex thích hợp đã chọn từ thí nghiệm a và b, pH tự nhiên của nguyên liệu, thời
gian thủy phân là 2 giờ. Nhiệt độ thủy phân ở 4 mẫu là 45 + 0,50C, 50 + 0,50C, 55 +
0,50C và 60 + 0,50C. Sau khi thủy phân, nâng nhiệt độ lên 900C trong 15 phút để bất
hoạt enzyme, sau đó lọc qua rây để tách xương rồi đem ly tâm với tốc độ 10.000 Nhũ tương
Tỷ lệ nước so với NL thích hợp Tỷ lệ Protamex so với NL thích hợp Thời gian thủy phân: 2 giờ
pH tự nhiên của nguyên liệu Đầu cá ngừ đã nghiền nhỏ đông lạnh
Rã đông
Thủy phân với
nhiệt độ khác nhau (0C)
Lọc
Bất hoạt enzyme
Dịch đạm thủy phân Ly tâm
Xác định hiệu suất thu hồi lipid. Xác định chỉ số axit, chỉ số peroxyt
Chọn nhiệt độ thủy phân thích hợp
Cặn Xương 60 + 0,5 55 + 0,5 50 + 0,5 Dầu cá 45 + 0,5 Dịch lọc
vòng/phút ở 40C trong 30 phút. Sau khi ly tâm, thu hồi dầu ở lớp trên cùng rồi tiến hành xác định hiệu suất thu hồi lipid, chỉ số axit và chỉ số peroxyt của dầu thu được. Dựa vào hiệu suất thu hồi lipid và hai chỉ số chất lượng này, ta chọn được nhiệt độ thủy phân thu hồi lipid thích hợp nhất đối với enzyme Protamex.
d. Bố trí thí nghiệm xác định thời gian thủy phân thích hợp để thu hồi lipid từ đầu cá ngừ vây vàng bằng enzyme Protamex
Hình 2.6. Sơ đồ bố trí thí nghiệm chọn thời gian thủy phân thích hợp để thu hồi lipid từ đầu cá ngừ vây vàng bằng enzyme Protamex
Nhũ tương
Tỷ lệ nước so với NL thích hợp Tỷ lệ Protamex so với NL thích hợp pH tự nhiên của nguyên liệu
Nhiệt độ thủy phân thích hợp Đầu cá ngừ đã nghiền nhỏ đông lạnh
Rã đông
Thủy phân với thời gian khác nhau (giờ)
Lọc
Bất hoạt enzyme
Dịch đạm thủy phân Ly tâm
Xác định hiệu suất thu hồi lipid. Xác định chỉ số axit, chỉ số peroxyt
Chọn thời gian thủy phân thích hợp
Xương 4 3 2 1 Dầu cá 0,5 Dịch lọc Cặn
Đầu cá ngừ vây vàng đã được nghiền nhỏ đông lạnh được đem rã đông rồi tiến hành thủy phân 5 mẫu với các thông số cố định là: tỷ lệ nước và tỷ lệ enzyme thích hợp đã chọn từ thí nghiệm a và b, pH tự nhiên của nguyên liệu và nhiệt độ thủy phân đã chọn được ở thí nghiệm c. Thời gian thủy phân ở 5 mẫu là 0,5 giờ, 1 giờ, 2 giờ, 3
giờ và 4 giờ. Sau khi thủy phân, nâng nhiệt độ lên 900C trong 15 phút để bất hoạt
enzyme, sau đó lọc qua rây để tách xương rồi đem ly tâm với tốc độ 10.000 vòng/phút
ở 40C trong 30 phút. Sau khi ly tâm, thu hồi dầu ở lớp trên cùng rồi tiến hành xác định
hiệu suất thu hồi lipid, chỉ số axit và chỉ số peroxyt của dầu thu được. Dựa vào hiệu suất thu hồi lipid và hai chỉ số chất lượng này, ta chọn được thời gian thủy phân thích hợp để thu hồi lipid từ đầu cá ngừ vây vàng bằng enzyme Protamex.
Sơ đồ bố trí thí nghiệm được thể hiện trong Hình 2.6
2.2.4.2. Bố trí thí nghiệm xác định các thông số thích hợp cho quá trình thủy phân thu hồi lipid từ đầu cá ngừ vây vàng bằng enzyme Alcalase theo phương pháp thăm dò cổ điển
a. Bố trí thí nghiệm xác định tỷ lệ nước so với nguyên liệu thích hợp cho quá trình thủy phân thu hồi lipid từ đầu cá ngừ vây vàng bằng enzyme Alcalase
Đầu cá ngừ vây vàng đã được nghiền nhỏ đông lạnh được đem rã đông rồi tiến hành thủy phân 5 mẫu với các thông số cố định là: tỷ lệ enzyme Alcalase so với
nguyên liệu là 0,5% (v/w), pH tự nhiên của nguyên liệu, nhiệt độ 60 + 0,50C với thời
gian thủy phân là 2 giờ. Tỷ lệ nước so với nguyên liệu ở 5 mẫu là 0%, 25%, 50%, 75%
và 100%. Sau khi thủy phân, nâng nhiệt độ lên 900C trong 15 phút để bất hoạt enzyme,
sau đó lọc qua rây để tách xương rồi đem dịch lọc ly tâm với tốc độ 10.000 vòng/phút
ở 40C trong 30 phút. Sau khi ly tâm, thu hồi dầu ở lớp trên cùng và tiến hành xác định
hiệu suất thu hồi lipid, chỉ số axit và chỉ số peroxyt của dầu thu được. Dựa vào hiệu suất thu hồi lipid và hai chỉ số chất lượng này, ta chọn được tỷ lệ nước thích hợp nhất cho quá trình thủy phân.
Hình 2.7. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định tỷ lệ nước so với nguyên liệu thích hợp cho quá trình thủy phân thu hồi lipid từ đầu cá ngừ vây vàng bằng enzyme Alcalase
Nhũ tương
Tỷ lệ Alcalase so với NL: 0,5% pH tự nhiên của nguyên liệu
Nhiệt độ thủy phân: 60 + 0,50C
Thời gian thủy phân: 2 giờ Đầu cá ngừ đã nghiền nhỏ đông lạnh
Rã đông
Thủy phân với tỷ lệ nước khác nhau (%)
Lọc
Bất hoạt enzyme
Dịch đạm thủy phân Ly tâm
Xác định hiệu suất thu hồi lipid. Xác định chỉ số axit, chỉ số peroxyt
Chọn tỷ lệ nước so với nguyên liệu thích hợp Cặn Xương 100 75 50 25 Dầu cá 0 Dịch lọc
b. Bố trí thí nghiệm xác định tỷ lệ enzyme Alcalase so với nguyên liệu thích hợp cho quá trình thủy phân thu hồi lipid từ đầu cá ngừ vây vàng
Hình 2.8. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định tỷ lệ enzyme Alcalase so với nguyên liệu thích hợp cho quá trình thủy phânthu hồi lipid từ đầu cá ngừ vây vàng
Đầu cá ngừ vây vàng đã được nghiền nhỏ đông lạnh được đem rã đông rồi tiến