d. Sự thủy phân các phế liệu cá bằng các enzyme protease thương mại và các
1.3.2. Tình hình nghiên cứu trong nước
Có thể thấy rằng, tận dụng phế liệu trong quá trình chế biến để tạo ra các sản phẩm có giá trị gia tăng như tách chiết thu hồi dầu cá từ phế liệu cá là một yêu cầu cấp thiết và là hướng đi khá mới mẻ hiện nay. Vì vậy, các công trình nghiên cứu trong
nước có liên quan đến vấn đề này đã được công bố vẫn còn rất ít. Nghiên cứu cơ bản về dầu cá trong nước có thể kể đến là “Nghiên cứu định lượng đồng thời các vitamin A, D, E trong dầu gan cá bằng phương pháp HPLC” của Thái Phan Quỳnh Như (1992) [13].
Hiện nay, việc nghiên cứu thu hồi dầu cá phổ biến có thể kể đến là tách chiết dầu từ mỡ của cá tra, cá basa để sản xuất dầu diesel sinh học giá rẻ. Điển hình là Công ty Trách nhiệm hữu hạn Minh Tú ở phường Phước Thới, quận Ô Môn, thành phố Cần Thơ đã nghiên cứu và sản xuất ra được dầu biodiesel từ mỡ cá tra, cá basa theo một quy trình công nghệ tự động hoá khép kín an toàn. Công ty đã thử nghiệm thành công việc tạo ra dầu biodiesel từ mỡ cá tra, các basa trong phòng thí nghiệm từ năm 2004. Cũng với hướng nghiên cứu này, năm 2008, Trần Kiều Oanh và Bùi Thị Bửu Huê, Trường Đại học Cần Thơ đã thực hiện đề tài nghiên cứu “Tổng hợp biodiesel từ mỡ cá basa” [14]. Bên cạnh đó, một số luận văn cao học được thực hiện tại trường Đại học Bách Khoa TP. Hồ Chí Minh lại tập trung vào việc tinh luyện dầu cá thô thành dầu mỡ thực phẩm. Cụ thể, Nguyễn Thanh Nguyên (2003) thực hiện đề tài “Nghiên cứu tinh
luyện dầu cá basa (Pangasius Bocourti) bằng phương pháp vật lý làm dầu mỡ thực
phẩm” [11]; Nguyễn Thị Hồng Ân (2008) với đề tài “Nghiên cứu chế biến mỡ cá da trơn” [1], “Nghiên cứu tinh luyện dầu cá” của Thái Lâm Phát (2008) [15]. Cùng hướng nghiên cứu này, Lê Phước Đức, trường Đại học Nha Trang đã thực hiện luận văn thạc sỹ “Nghiên cứu tinh luyện dầu cá tra” (2007) [2]. Không dừng lại ở đó, nhiều công trình khoa học trong thời gian gần đây đang tập trung vào việc nghiên cứu tách chiết, làm giàu các axit béo không no đa nối đôi (PUFA) như DHA và EPA trong các loại dầu cá thu hồi từ các phế liệu thủy sản như cá trích, cá ba sa, cá tra…để bổ sung vào thực phẩm, thay thế cho DHA tổng hợp nhập ngoại. Năm 2007, TS. Lại Mai Hương, Khoa Công nghệ Hóa học, Trường Đại học Bách Khoa TP. Hồ Chí Minh đã thực hiện đề tài “Tách axit béo không no đa nối đôi từ dầu cá ngừ bằng phương pháp tạo phức với ure” [4]. Cũng trong năm đó, tác giả này tiếp tục nghiên cứu thực hiện đề tài “Kết tinh phân đoạn axit béo không no nhiều nối đôi từ dầu cá trích và cá ba sa” [5].
Đối với nguyên liệu cá ngừ đại dương, do ngành công nghiệp khai thác và chế biến cá ngừ đại dương mới chỉ phát triển ở nước ta trong những năm gần đây nên hiện tại chưa có nhiều công trình nghiên cứu tận dụng các phế liệu của loại cá này sau quá trình chế biến.
TS. Nguyễn Thị Mỹ Hương (2009) đã nghiên cứu tận dụng đầu cá ngừ vây vàng để sản xuất sản phẩm thủy phân protein ứng dụng trong việc sản xuất thức ăn cho tôm và trong sản xuất nước mắm [7]. Ảnh hưởng của những sản phẩm thủy phân này đến sự sống và phát triển của tôm cũng đã được nghiên cứu bởi tác giả này (2011) [8]. Kết quả nghiên cứu cho thấy việc bổ sung sản phẩm thủy phân đầu cá ngừ vào thức ăn đã cải thiện được sự tăng khối lượng của tôm, hệ số chuyển hóa thức ăn và hiệu quả sử dụng protein.
Như vậy, cho đến hiện nay, vẫn chưa có công trình nào trong nước nghiên cứu tách chiết thu hồi dầu cá từ phế liệu đầu cá ngừ đại dương bằng phương pháp thủy phân sử dụng enzyme.
CHƯƠNG 2
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU
2.1.1. Đầu cá ngừ
Đầu cá ngừ vây vàng được thu mua từ Công ty trách nhiệm hữu hạn Thịnh Hưng – Khu công nghiệp Suối Dầu – Cam Lâm – Khánh Hòa.
Đầu cá ngừ sau khi mua được đựng trong thùng xốp cách nhiệt có bảo quản nước
đá, nhiệt độ 0 - 4oC và được vận chuyển ngay về phòng thí nghiệm. Tiếp đó, nguyên
liệu được rửa sạch, xay nhỏ, trộn đều và cho vào mỗi túi nhựa 400g đầu cá đã xay (khối lượng cho một mẫu thí nghiệm). Nguyên liệu sau đó được bao gói hút chân
không và bảo quản đông ở nhiệt độ -200C cho đến khi sử dụng để tiến hành thí
nghiệm.
2.1.2. Enzyme
Các enzyme protease thương mại sử dụng trong đề tài (Alcalase, Protamex, Flavourzyme) thuộc hãng Novozymes (Denmark).
Thông tin cụ thể về từng loại enzyme như sau:
- Enzyme Protamex: là enzyme endoprotease của Bacillus sp., thường được
dùng để thủy phân protein thực phẩm. Điều kiện hoạt động tối ưu của enzyme
Protamex trong khoảng pH 5,5 – 7,5; nhiệt độ 35 – 600C. Enzyme này bị bất hoạt ở
850C trong 10 phút và ở pH = 8. Hoạt độ của Protamex là 1,5 AU / g.
- Enzyme Alcalase: là enzyme endoprotease của vi khuẩn được sản xuất từ một
chủng của Bacillus lichenformis. Điều kiện hoạt động tối ưu của enzyme Alcalase là:
pH từ 6,5 – 8,5; nhiệt độ từ 55 – 700C. Hoạt độ của Alcalase là 2,4 AU/g.
- Enzyme Flavourzyme: là enzyme mang cả tính chất exoprotease và
endoprotease được sản xuất từ nấm mốc Aspergillus oryzae bằng quá trình lên men
chìm. Điều kiện hoạt động tối ưu của enzyme Flavourzyme là: pH từ 5 - 7; nhiệt độ 50
- 550C. Hoạt độ của Flavourzyme là 500 LAPU/g.
Ở pH môi trường tự nhiên của nguyên liệu thủy sản, enzyme này có thể hoạt động tốt mà không cần điều chỉnh pH. Do vậy, quá trình thủy phân đầu cá ngừ được
thực hiện ở pH tự nhiên. Điều này giúp giảm chi phí điều chỉnh pH và đơn giản hóa công nghệ khi triển khai sản xuất với quy mô công nghiệp.
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.2.1. Sơ đồ nghiên cứu tổng quát 2.2.1. Sơ đồ nghiên cứu tổng quát
Quá trình nghiên cứu có thể được tổng quát theo sơ đồ Hình 2.1.
Hình 2.1. Sơ đồ nghiên cứu tổng quát
2.2.2. Phân tích các thành phần hóa học cơ bản trong đầu cá ngừ vây vàng
Đầu cá ngừ vây vàng được xác định các thành phần hóa học sau:
1. Xác định độ ẩm theo phương pháp chuẩn AOAC 950.46 (2000) [31].
2. Xác định hàm lượng tro theo phương pháp chuẩn AOAC 923.03 (2000) [31]. Nghiên cứu xác định các thông số thích hợp cho quá trình thủy phân thu hồi lipid (tỷ lệ nước so với nguyên liệu, tỷ lệ enzyme so với nguyên liệu, nhiệt độ thủy phân, thời gian thủy phân) đối với từng loại enzyme (Alcalase, Protamex, Flavourzyme) bằng phương pháp thăm dò cổ điển.
Sản xuất dầu theo các thông số thích hợp đã xác định được đối với từng loại enzyme. So sánh hiệu suất thu hồi lipid và chất lượng dầu thu được từ quá trình thủy phân bằng 3 loại enzyme trên. Lựa chọn loại enzyme
hiệu quả nhất.
Sản xuất dầu theo các thông số tối ưu đã xác định được và đánh giá chất lượng của dầu thô thành phẩm thu được.
Xác định các thành phần hóa học cơ bản của đầu cá ngừ vây vàng.
Tối ưu hóa các thông số của chế độ thủy phân sử dụng enzyme đã chọn bằng phương pháp quy hoạch thực nghiệm.
3. Xác định hàm lượng đạm tổng số theo phương pháp chuẩn AOAC 987.04 (2000) [31].
(Hàm lượng protein = 6,25 x Hàm lượng đạm tổng số)
4. Xác định hàm lượng lipid tổng số theo phương pháp Folch (1957) [52].
2.2.3. Quy trình dự kiến thu hồi dầu thô từ đầu cá ngừ vây vàng theo phương pháp thủy phân bằng enzyme pháp thủy phân bằng enzyme
Sơ đồ quy trình thu hồi dầu thô từ đầu cá ngừ vây vàng theo phương pháp thủy phân bằng enzyme được thể hiện trong Hình 2.2.
Hình 2.2. Sơ đồ quy trình dự kiến thu hồi dầu thô từ đầu cá ngừ vây vàng bằng phương pháp thủy phân
Xay nhỏ
Thủy phân
Tỷ lệ nước so với nguyên liệu Tỷ lệ enzyme so với nguyên liệu Nhiệt độ thủy phân
Thời gian thủy phân pH môi trường Lọc Dịch đạm thủy phân Cặn ly tâm Bất hoạt enzyme Ly tâm Xương Rửa sạch Dầu cá Đầu cá ngừ vây vàng Dịch lọc Nhũ tương
Thuyết minh quy trình:
1. Nguyên liệu – Rửa:
Nguyên liệu là các loài cá hoặc phế liệu cá đảm bảo tươi tốt, nguyên liệu có thể được qua bảo quản lạnh, bảo quản đông. Nguyên liệu phải được rửa sạch tạp chất, cát sạn.
2. Xay nhỏ:
Mục đích của xay nhỏ là:
- Phá vỡ kết cấu tế bào, giúp cho lipid tự do nằm trong các tế bào và mô dễ dàng thoát ra ngoài.
- Tế bào bị phá vỡ làm tăng diện tích tiếp xúc của nguyên liệu với enzyme để rút ngắn thời gian thủy phân và quá trình thủy phân được triệt để hơn.
Quá trình xay nhỏ được thực hiện trên máy xay trục vít có đường kính mắt sàng d = 3 – 4 mm.
3. Thủy phân:
Sử dụng một số enzyme protease thương mại như Protamex, Alcalase, Flavourzyme… để thực hiện sự thủy phân. Đây là công đoạn chính quan trọng nhất trong quá trình tách dầu. Trong quá trình thủy phân, ngoài việc protein bị thủy phân thành axit amin và peptide nhờ enzyme protease thì quá trình thủy phân còn làm phá vỡ tế bào mô mỡ giúp giải phóng dầu (Dumay và cộng sự, 2006) [47]. Đồng thời, sự tác động của enzyme protease vào protein làm yếu liên kết giữa protein – lipid, tạo điều kiện giúp lipid liên kết giải phóng ra ngoài.
Thao tác thủy phân tiến hành như sau: Thịt cá đã nghiền nhỏ có thể trộn với một lượng nước cất nhất định, hỗn hợp được đun nóng đến khi đạt nhiệt độ nhất định. Bổ sung enzyme với tỷ lệ phù hợp, giữ ổn định nhiệt độ trong suốt quá trình thủy phân, cần khuấy đảo để tăng cường quá trình thủy phân.
4. Bất hoạt enzyme:
Để kết thúc quá trình thủy phân, enzyme được bất hoạt bằng cách nâng nhiệt hỗn
hợp thủy phân lên 900C trong 15 phút (Guerard và cộng sự, 2002; Liaset và cộng sự,
2003; Ovissipour và cộng sự, 2009) [56], [67], [80]. Việc nâng nhiệt còn giúp tiêu diệt vi sinh vật có hại, giảm độ nhớt của khối hỗn hợp thủy phân, tạo điều kiện cho quá trình phân ly được dễ dàng hơn.
5. Lọc:
Hỗn hợp sau thủy phân đem lọc qua rây để tách xương và phần dịch lọc.
6. Ly tâm:
Dịch lọc được đem ly tâm. Sau khi ly tâm, sản phẩm thu được gồm 4 phần: phần dầu ở lớp trên cùng, một ít nhũ tương, dịch đạm thủy phân ở giữa và phần cặn ly tâm (chứa protein chưa thủy phân, peptide không tan…) ở dưới cùng. Tiến hành thu hồi
dầu rồi đem đi bảo quản ở nhiệt độ -18 đến -200C.
2.2.4. Bố trí thí nghiệm xác định các thông số thích hợp cho quá trình thủy phân thu hồi lipid từ đầu cá ngừ vây vàng bằng 3 loại enzyme theo phương pháp phân thu hồi lipid từ đầu cá ngừ vây vàng bằng 3 loại enzyme theo phương pháp thăm dò cổ điển
Quá trình thủy phân được thực hiện với pH cố định là giá trị pH tự nhiên của nguyên liệu với lý do đã được trình bày trong mục 2.1.2. Trên cơ sở tham khảo một số công trình nghiên cứu trước đây, 4 thông số ảnh hưởng đến hiệu suất thu hồi dầu và chất lượng dầu cần nghiên cứu là:
- Tỷ lệ nước so với nguyên liệu - Tỷ lệ enzyme so với nguyên liệu - Nhiệt độ thủy phân
- Thời gian thủy phân.
Việc lựa chọn các thông số thích hợp cho quá trình thủy phân thu hồi lipid dựa vào 3 chỉ tiêu: hiệu suất thu hồi lipid, chỉ số axit và chỉ số peroxyt của dầu thu được. Chỉ số axit và chỉ số peroxyt lần lượt thể hiện mức độ thủy phân và oxy hóa của dầu.
2.2.4.1. Bố trí thí nghiệm xác định các thông số thích hợp cho quá trình thủy phân thu hồi lipid từ đầu cá ngừ vây vàng bằng enzyme Protamex theo phương phân thu hồi lipid từ đầu cá ngừ vây vàng bằng enzyme Protamex theo phương pháp thăm dò cổ điển
a. Bố trí thí nghiệm xác định tỷ lệ nước so với nguyên liệu thích hợp cho quá trình thủy phân thu hồi lipid từ đầu cá ngừ vây vàng bằng enzyme Protamex trình thủy phân thu hồi lipid từ đầu cá ngừ vây vàng bằng enzyme Protamex
Hình 2.3. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định tỷ lệ nước so với nguyên liệu thích hợp cho quá trình thủy phân thu hồi lipid từ đầu cá ngừ vây vàng bằng Protamex
Đầu cá ngừ vây vàng đã được nghiền nhỏ đông lạnh được đem rã đông rồi tiến hành thủy phân 5 mẫu với các thông số cố định là: tỷ lệ enzyme Protamex so với
nguyên liệu là 0,5%, pH tự nhiên của nguyên liệu, nhiệt độ thủy phân 50 + 0,50C với
Nhũ tương
Tỷ lệ Protamex so với NL: 0,5% pH tự nhiên của nguyên liệu
Nhiệt độ thủy phân: 50 + 0,50C
Thời gian thủy phân: 2 giờ Đầu cá ngừ đã nghiền nhỏ đông lạnh
Rã đông
Thủy phân với tỷ lệ nước khác nhau (%)
Lọc
Bất hoạt enzyme
Dịch đạm thủy phân Ly tâm
Xác định hiệu suất thu hồi lipid. Xác định chỉ số axit, chỉ số peroxyt
Chọn tỷ lệ nước so với nguyên liệu thích hợp Cặn Xương 100 75 50 25 Dầu cá 0 Dịch lọc
thời gian thủy phân là 2 giờ. Tỷ lệ nước so với nguyên liệu ở 5 mẫu là 0%, 25%, 50%,
75% và 100%. Sau khi thủy phân, nâng nhiệt độ lên 900C trong 15 phút để bất hoạt
enzyme, sau đó lọc qua rây để tách xương rồi đem dịch lọc ly tâm với tốc độ 10.000
vòng/phút ở 40C trong 30 phút. Sau khi ly tâm, thu hồi dầu ở lớp trên cùng và tiến
hành xác định hiệu suất thu hồi lipid, chỉ số axit và chỉ số peroxyt của dầu thu được. Dựa vào hiệu suất thu hồi lipid và hai chỉ số chất lượng này, ta chọn được tỷ lệ nước thích hợp nhất cho quá trình thủy phân thu hồi dầu từ đầu cá ngừ vây vàng bằng enzyme Protamex.
b. Bố trí thí nghiệm xác định tỷ lệ enzyme Protamex so với nguyên liệu thích hợp cho quá trình thủy phân thu hồi lipid từ đầu cá ngừ vây vàng hợp cho quá trình thủy phân thu hồi lipid từ đầu cá ngừ vây vàng
Đầu cá ngừ vây vàng đã được nghiền nhỏ đông lạnh được đem rã đông rồi tiến hành thủy phân 5 mẫu với các thông số cố định là: tỷ lệ nước thích hợp đã chọn từ thí
nghiệm a, pH tự nhiên của nguyên liệu, nhiệt độ 50 + 0,50C với thời gian thủy phân là
2 giờ. Tỷ lệ enzyme Protamex so với nguyên liệu ở 5 mẫu là 0,1%, 0,3%, 0,5%, 0,7%
và 0,9% (w/w). Sau khi thủy phân, nâng nhiệt độ lên 900C trong 15 phút để bất hoạt
enzyme, sau đó lọc qua rây để tách xương rồi đem ly tâm với tốc độ 10.000 vòng/phút
ở nhiệt độ 40C trong 30 phút. Sau khi ly tâm, thu hồi dầu ở lớp trên cùng rồi tiến hành
xác định hiệu suất thu hồi lipid, chỉ số axit và chỉ số peroxyt của dầu thu được. Dựa vào hiệu suất thu hồi lipid và hai chỉ số chất lượng, ta chọn được tỷ lệ enzyme Protamex thích hợp cho quá trình thủy phân.
Hình 2.4. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định tỷ lệ enzyme Protamex so với nguyên liệu thích hợp cho quá trình thủy phân thu hồi lipid
c. Bố trí thí nghiệm xác định nhiệt độ thủy phân thích hợp để thu hồi lipid từ đầu cá ngừ vây vàng bằng enzyme Protamex
Sơ đồ bố trí thí nghiệm được thể hiện trong Hình 2.5.
Nhũ tương
Tỷ lệ nước so với NL thích hợp pH tự nhiên của nguyên liệu
Nhiệt độ thuỷ phân: 50 + 0,50C
Thời gian thủy phân: 2 giờ Đầu cá ngừ đã nghiền nhỏ đông lạnh
Rã đông
Thủy phân với tỷ lệ enzyme Protamex khác nhau (%)
Lọc
Bất hoạt enzyme
Dịch đạm thủy phân Ly tâm
Xác định hiệu suất thu hồi lipid. Xác định chỉ số axit, chỉ số peroxyt
Chọn tỷ lệ enzyme Protamex so với nguyên liệu thích hợp