d. Sự thủy phân các phế liệu cá bằng các enzyme protease thương mại và các
1.3.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới
Phế liệu cá (hay còn gọi là nguyên liệu còn lại sau chế biến) có thể là nguồn cung cấp lipid rất tốt cho sức khỏe khi sử dụng nó vào các sản phẩm dinh dưỡng cho người và động vật (Falch, 2006) [50]. Việc sử dụng dầu cá cho tiêu dùng của con người đang ngày càng tăng lên trong vài thập niên gần đây (Aidos, 2002) [29] và các nghiên cứu về dinh dưỡng đã cho thấy rằng hầu hết con người không có đủ các axit béo ω-3 trong khẩu phần ăn của họ (Horrock và Yeo, 1999; Simopolous 2002) [58], [95]. Hàm lượng các axit béo không bão hòa đa nối đôi mạch dài đặc trưng như axit eicosapentaenoic (EPA) và axit docosahexaenoic (DHA) làm cho các lipid từ thủy sản trở nên đáng chú ý hơn so với các nguồn lipid khác. EPA đóng vai trò quan trọng trong việc ngăn ngừa các bệnh về tim mạch và DHA có tác dụng tăng cường sự phát triển trí não (Uauy and Valenzuela, 2000; Stillwell và Wassall, 2003; Calder, 2004) [105], [102], [38].
Có một số phương pháp khác nhau để trích ly dầu từ nguyên liệu cá ngừ tươi và các phế liệu cá ngừ. Bao gồm phương pháp ép ướt, phương pháp ép khô, phương pháp thủy phân, và tách chiết bằng dung môi. Phương pháp ép ướt được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp chế biến dầu cá. Các bước chính của phương pháp này là nấu, ép và phân tách (Bimbo, 1990) [36]. Dầu thô từ phế liệu cá ngừ (đầu cá ngừ sọc dưa) đã qua nấu chín và chưa qua nấu chín đã được tách chiết bằng phương pháp ép ướt, với lượng
dầu thu hồi tương ứng là 2,8 và 4,8 g/100g nguyên liệu (Chantanchum và cộng sự, 2000) [39]. Nhìn chung, phương pháp này mang lại hiệu quả cao đối với các nguyên liệu hoặc phế liệu cá có hàm lượng dầu cao như cá trích, cá ngừ, cá mòi, cá hồi…nhưng lại không hiệu quả đối với các nguyên liệu có hàm lượng dầu thấp (Rubio- Rodriguez và cộng sự, 2010) [84]. Một phương pháp khác được sử dụng là tách chiết dầu bằng dung môi. Dầu từ các phế liệu cá ngừ có thể thu được bằng phương pháp này. Các kết quả đã chỉ ra rằng mắt và đầu cá ngừ chứa 14 – 18% dầu trong khi ruột chỉ chứa khoảng 2,8 – 3,9% dầu (Kungsuwan và cộng sự, 1996).
Cùng với sự tiến bộ của khoa học kỹ thuật, phương pháp tách chiết dầu cá cũng đã có những thay đổi đáng kể. Dầu cá là một sản phẩm chủ yếu được sản xuất từ nguyên liệu còn lại của cá và được sản xuất theo truyền thống bằng cách nấu và ép, sau đó phân riêng bằng ly tâm. Các quy trình này có thể gây nên sự phân hủy lipid nhanh, vì vậy sự tách chiết lipid nhẹ nhàng hơn có thể tạo nên các phần lipid bền hơn (Dauksas và cộng sự, 2005) [43]. Do đó, việc sử dụng các enzyme trong các quá trình công nghiệp để thu hồi dầu cá mới được sử dụng gần đây nhưng đã trở thành một sự thay thế tốt cho các phương pháp truyền thống vì nó đơn giản hơn và chi phí đầu tư thấp hơn, ít tiêu tốn năng lượng. Dưới tác dụng của enzyme, các phân tử protein bị phân giải thành một loạt các peptide nhỏ hơn và các amino axit, đồng thời các mô bị phá vỡ, thúc đẩy dầu được giải phóng ra ngoài dễ dàng hơn. Ưu điểm chính đối với phương pháp tách chiết dầu bằng enzyme là nó có thể được tiến hành dưới các điều
kiện nhẹ nhàng như: nhiệt độ thấp (< 600C) nên hạn chế đến mức tối thiểu sự oxy hóa
các axit béo không bão hòa đa nối đôi (PUFA), không sử dụng dung môi hữu cơ và quá trình thủy phân tiến hành trong một khoảng thời gian ngắn (Mbatia, 2011) [73]. Chính những ưu điểm này đã thúc đẩy các công trình nghiên cứu dựa trên việc sử dụng công nghệ enzyme để thu hồi lipid từ cá và các phế liệu của chúng (Rubio-Rodriguez và cộng sự, 2010) [84]. Đối tượng nghiên cứu của các công trình này chủ yếu tập trung vào các phế liệu của quá trình chế biến các mặt hàng thủy sản, với mục đích tăng hiệu quả lợi nhuận từ việc tận dụng tối đa các phế liệu của quá trình sản xuất.
Các protease thương mại phổ biến sử dụng để thủy phân protein cá được thu từ cả nguồn thực vật như papain hoặc từ nguồn động vật như pepsin, trypsin và chymotrypsin. Các enzyme thu từ nguồn vi sinh vật cũng được ứng dụng cho mục đích này. So với enzyme thu được từ thực vật hoặc động vật, enzyme từ vi sinh vật mang
đến nhiều ưu điểm bao gồm hoạt tính xúc tác đa dạng, sự ổn định về pH và nhiệt độ tốt hơn.
Liaset và cộng sự (2003) đã nghiên cứu quá trình thủy phân các phần còn lại của cá hồi sau khi fillet bằng các enzyme protease và sau đó nghiên cứu thành phần hóa học của các phần khác nhau thu được sau quá trình phân riêng bằng ly tâm. Kết quả nghiên cứu cho thấy rằng phương pháp thủy phân bằng enzyme thu được dầu cá giàu hàm lượng ω-3 với hiệu suất thu hồi cao (khoảng 77%) cũng như thu được nhiều thành phần khác có giá trị như: các peptid và các axit amin không thay thế. [67]
Các enzyme thương mại sử dụng để thủy phân protein có rất nhiều loại với các điều kiện hoạt động tối ưu khác nhau. Vì vậy, các thông số của quá trình thủy phân để tạo điều kiện tốt nhất cho hoạt động của từng loại enzyme là mục đích chính của các công trình nghiên cứu. Bên cạnh đó, nhiều nhà nghiên cứu đã so sánh các loại enzyme protease thương mại với nhau để kiểm tra xem loại nào thích hợp nhất đối với quá trình thủy phân protein cá.
Alcalase, một enzyme có tính kiềm, được sinh ra từ Bacillus licheniformis, đã
được nhận thấy trong nhiều nghiên cứu là một trong những loại enzyme tốt nhất để sản xuất các sản phẩm thủy phân từ protein cá. Alcalase tạo ra các sản phẩm thủy phân có hiệu suất thu hồi protein cao nhất và hàm lượng lipid thấp nhất so với các sản phẩm thủy phân thu được khi sử dụng Papain và Neutrase (Shahidi và cộng sự, 1995) [91]. Gbogouri và cộng sự (2006) đã nghiên cứu quá trình thủy phân đầu cá hồi tươi bằng các enzyme Alcalase, Neutrase và Protamex. Kết quả nghiên cứu cho thấy rằng Alcalase là enzyme mang lại hiệu quả thu hồi dầu cao nhất [54]. Kết luận tương tự về tính hiệu quả của Alcalase cũng đã được khẳng định bởi Mahmoud và cộng sự (2008) [71] khi nghiên cứu về quá trình tách chiết dầu từ trứng cá hồi bằng enzyme Alcalase, Neutrase và Protamex. Ngoài Alcalase, một số enzyme thương mại được sử dụng phổ biến bao gồm Protamex, Flavourzyme, Neutrase, Lecitase… Protamex là một hỗn hợp protease thương mại thường được lựa chọn ứng dụng trong thủy phân protein cá vì có ưu điểm là chúng thủy phân tạo ra các sản phẩm thủy phân không có vị đắng (Liaset và cộng sự, 2003) [67]. Flavourzyme là một hỗn hợp protease / peptidase nấm mốc thường được sử dụng để thủy phân protein dưới các điều kiện môi trường trung tính hoặc axit nhẹ (Dauksas và cộng sự, 2005) [43].
Năm 2002, Liaset và cộng sự đã sử dụng enzyme Protamex để thủy phân các phần còn lại của cá hồi sau khi fillet. Kết quả nghiên cứu cho thấy sau khi thủy phân
với các điều kiện hoạt động tối ưu của enzyme Protamex (nhiệt độ 55 + 20C, tỷ lệ
nguyên liệu / nước = 1,14, tỷ lệ enzyme / cơ chất = 11,1 AU / kg, thời gian thủy phân 60 phút) thì phần lipid thu được sau quá trình ly tâm xấp xỉ 77% lượng lipid tổng số có trong nguyên liệu ban đầu và phần lipid này có chứa hàm lượng EPA và DHA cao.[66] Linder, Fanni, và Parmentier (2005) đã sử dụng các enzyme thương mại khác nhau: Alcalase, Neutrase và Flavourzyme để tách chiết dầu từ đầu cá hồi đã nghiền
nhỏ ở nhiệt độ thủy phân trung bình (550C). Họ kết luận rằng hiệu suất thu hồi dầu cao
nhất (17,4% sau 2h) đạt được khi sử dụng Alcalase, gần với hiệu suất thu hồi dầu đạt được bằng phương pháp Bligh and Dyer (20%). [69]
Slizyté và cộng sự (2005) đã nghiên cứu sự thủy phân các phế liệu của cá tuyết bằng enzyme Flavourzyme và Neutrase tương ứng. Các tác giả này đã nghiên cứu ảnh hưởng của thành phần trạng thái cơ chất đến hiệu suất thu hồi và thành phần hóa học của các sản phẩm thu được (phần dầu, protein thủy phân, nhũ tương và cặn ly tâm) [98]. Cũng trong năm 2005 và cùng đối tượng là phế liệu cá tuyết, họ tiếp tục nghiên cứu ảnh hưởng của sự bất hoạt bằng nhiệt các enzyme nội tại có trong nguyên liệu, sự bổ sung nước trước khi thủy phân, việc sử dụng các enzyme thương mại khác nhau (Alcalase và Lecitase) và sự kết hợp các loại enzyme đến hiệu suất và thành phần hóa học của dầu được tách chiết. Các thông số của quá trình thủy phân như sau: tỷ lệ nước
bổ sung / nguyên liệu là 1/1, nhiệt độ thủy phân là 500C, tỷ lệ mỗi loại enzyme /
nguyên liệu bổ sung là 0,1% (w/w) và thời gian thủy phân là 60 phút. Kết quả nghiên cứu cho thấy lượng dầu phân tách được cao nhất khi gia nhiệt để bất hoạt enzyme nội tại trước khi thủy phân và không bổ sung thêm nước. Các xử lý này cũng làm giảm lượng nhũ tương, một sản phẩm không mong muốn sau quá trình thủy phân vì nhiệt ban đầu làm biến tính protein và do đó làm giảm các tính chất nhũ hóa của chúng. Thủy phân với Alcalase không bổ sung thêm nước mang lại sản phẩm thủy phân với hàm lượng lipid thấp nhất, nhưng hiệu suất thu hồi lipid trong pha dầu cao [99].
Dauksas và cộng sự (2005) đã nghiên cứu thành phần của các axit béo và các loại lipid có trong các sản phẩm thu được từ quá trình thủy phân phế liệu cá tuyết lần lượt với enzyme Flavourzyme, Neutrase và không bổ sung enzyme. Ảnh hưởng của việc bổ
sung nước trong quá trình thủy phân cũng đã được nghiên cứu. Trong đó, các thông số cho quá trình thủy phân đối với Flavourzyme là: tỷ lệ enzyme bổ sung 0,1% (so với
khối lượng nguyên liệu), nhiệt độ thủy phân 500C và thời gian thủy phân là 60 phút.
Kết quả đã chỉ ra rằng hiệu suất thu dầu cao nhất đạt được khi không bổ sung nước trong quá trình thủy phân và sử dụng Neutrase đem lại lượng lipid trong sản phẩm thủy phân và trong nhũ tương ít hơn, nhưng hiệu suất thu hồi lipid trong phần dầu cao hơn. [43]
Sathivel và cộng sự (2005) nghiên cứu thủy phân đầu cá hồi đỏ bằng các loại enzyme thương mại như Alcalase, Flavourzyme 500L, Palatase 2000L và Neutrase với tỷ lệ enzyme / nguyên liệu bổ sung là 0,5% (0,5g enzyme trên 100g protein đầu cá
xay) và nhiệt độ thủy phân là 500C. Nội dung của công trình này là nghiên cứu ảnh
hưởng của các loại enzyme khác nhau và thời gian thủy phân khác nhau (25, 50, 75 phút) đến đặc tính chức năng và giá trị dinh dưỡng của sản phẩm thủy phân đầu cá hồi đỏ. Các tác giả này cho rằng quá trình tách chiết dầu cá bằng việc sử dụng công nghệ enzyme có hiệu suất thu hồi dầu tốt hơn so với các phương pháp nhiệt. [86]
Dumay và cộng sự (2006) đã nghiên cứu hoàn thiện quy trình thu hồi lipid và phospholipid từ nội tạng cá mòi sử dụng các enzyme thương mại như: Flavourzyme, Protamex, Alcalase. Trong đó, quá trình thủy phân được tiến hành như sau: Phế liệu cá đã trộn đều được đồng hóa với nước (tỷ lệ 1/1, w/w) rồi được điều chỉnh về giá trị pH
8 (với NaOH 1M) và được giữ ở 500C. Enzyme (0,1%, w/w đối với Alcalase và
Protamex và 1,5%, w/w đối với Flavourzyme) được bổ sung vào trong hỗn hợp. Quá trình thủy phân tiến hành trong 24h kết hợp khuấy đảo liên tục. Kết quả nghiên cứu cho thấy hàm lượng lipid tổng số trong các phần chất lỏng sau khi ly tâm (phần dầu và phần dung dịch) tăng lên (ít nhất 85% các lipid đã được xác định có trong nguyên liệu có mặt trong các pha này). Điều này có thể giúp cải thiện sự thu hồi lipid đối với các ứng dụng mang tính thương mại. Thêm vào đó, các phần lipid này giàu các phosphoslipid hơn lipid được chiết bằng phương pháp hóa học cổ điển, đặc biệt là sau khi thủy phân bằng Alcalase. [47]
Mahmoud và cộng sự (2008) đã nghiên cứu đặc trưng hóa các phần lipid thu được từ trứng cá hồi bằng phương pháp thủy phân protein và phương pháp hóa học.
Phương pháp thủy phân sử dụng các enzyme Alcalase, Neutrase và Protamex với các thông số của quá trình thủy phân đối với từng enzyme như sau:
Enzyme Alcalase: tỷ lệ nước / nguyên liệu là 1/1; pH = 8; tỷ lệ enzyme / nguyên
liệu = 0,01% (v/w); nhiệt độ thủy phân là 580C và thời gian thủy phân là 120 phút.
Enzyme Protamex: tỷ lệ nước / nguyên liệu là 1/1; pH = 7,5; tỷ lệ enzyme /
nguyên liệu = 0,02% (w/w); nhiệt độ thủy phân là 500C và thời gian thủy phân là 120
phút.
Enzyme Neutrase: tỷ lệ nước / nguyên liệu là 1/1; pH = 6,0; tỷ lệ enzyme /
nguyên liệu = 0,01% (w/w); nhiệt độ thủy phân là 400C và thời gian thủy phân là 120
phút.
Kết quả nghiên cứu cho thấy các kết quả tốt nhất thu được khi sử dụng Alcalase. Hàm lượng dầu tách chiết được sau khi thủy phân là 3,7 g/100g nguyên liệu so với 9,6 g/100g nguyên liệu thu được bằng phương pháp hóa học. Lượng axit béo không no đa nối đôi (PUFA) trong pha dầu thì cao (41,8%) với 34,7% axit béo ω-3 trên tổng lượng lipid. [71]
Ảnh hưởng của tỷ lệ nước đến quá trình thủy phân phế liệu cá bơn đã được nghiên cứu bởi Sylla và các cộng sự (2008). Trong nghiên cứu này, ảnh hưởng của 4 tỷ lệ nước khác nhau (10%, 25%, 50% và 100% so với nguyên liệu) đến quá trình thủy phân phế liệu cá bơn bằng enzyme Protamex được so sánh. Quá trình thủy phân được
thực hiện ở pH = 6, nhiệt độ 400C, thời gian thủy phân là 6h. Kết quả nghiên cứu cho
thấy tỷ lệ nước tốt nhất cho quá trình thủy phân là 10%. [103]
Slizyté và cộng sự (2009) đã nghiên cứu đặc tính chức năng, hoạt tính sinh học và khả năng chống oxy hóa của sản phẩm thủy phân thu được từ xương cá tuyết (Gadus morhua). Trong đó, quá trình thủy phân bằng enzyme Protamex được thực
hiện ở 550C với tỷ lệ nước / nguyên liệu là 1:1, tỷ lệ enzyme là 0,1%, thời gian thủy
phân nghiên cứu là 10, 25, 45 và 60 phút. [97]
Ovissipour và cộng sự (2010) đã tiến hành nghiên cứu thủy phân đầu cá ngừ vây vàng Yellowfin bằng enzyme Alcalase và Protamex. Trong đó, lượng enzyme Protamex và Alcalase đưa vào thủy phân so với nguyên liệu lần lượt là 1,5% (w/w) và
1,5% (v/w), tỷ lệ nước / nguyên liệu = 1:1, quá trình thủy phân tiến hành ở pH tự nhiên
của nguyên liệu ở 550C trong 24 giờ. [81]
Cũng sử dụng enzyme Protamex có công trình nghiên cứu “Thủy phân các phế liệu của cá ngừ vây vàng (Thunnus albacares) bằng enzyme Protamex” của Nguyen và
cộng sự (2011) [76]. Trong đó, quá trình thủy phân được tiến hành ở 450C, pH tự
nhiên, sử dụng enzyme Protamex với tỷ lệ 0,1% với thời gian thủy phân là 12 giờ. Laplante và cộng sự (2009) đã tiến hành nghiên cứu so sánh hiệu quả tách chiết thu hồi dầu từ cá thu và cá trích theo 2 phương pháp tách chiết nhiệt độ thấp là phương
pháp tách chiết bằng CO2 siêu tới hạn và phương pháp thủy phân bằng enzyme
Protamex. Trong đó, quá trình thủy phân được tiến hành ở các điều kiện: pH 7, nhiệt
độ 450C, thời gian thủy phân 2,5 giờ, tỷ lệ enzyme / nguyên liệu là 0,01% (w/w), tỷ lệ
nước / nguyên liệu là 1/1 (w/w). Kết quả cho thấy hiệu suất thu hồi dầu từ hai loại cá này đạt được khi sử dụng phương pháp thủy phân cao hơn so với phương pháp chiết
CO2 siêu tới hạn, hay nói cách khác, quá trình tách chiết bằng phương pháp thủy phân
thể hiện hiệu quả có thể so sánh hoặc tốt hơn tách chiết dầu bằng CO2 siêu tới hạn.
Bên cạnh đó, chi phí sản xuất đối với phương pháp thủy phân lại thấp hơn, do đó phương pháp này cũng có thể là một lựa chọn tốt hơn khi sản xuất dầu ở quy mô công nghiệp. [64]
Khiari (2010) đã tiến hành đánh giá dầu thu hồi từ đầu và da cá thu bằng các phương pháp tách chiết khác nhau, bao gồm: phương pháp hóa học (dùng dung môi hữu cơ và kiềm), phương pháp vật lý và phương pháp enzyme. Hiệu suất thu hồi dầu theo phương pháp dùng dung môi hữu cơ hexan đạt cao nhất (> 90%) Đối với phương