Cõn 8 kg dƣợc liệu (nụ vối) làm khụ, chiết bằng ethanol 96% bằng phƣơng phỏp ngõm lạnh, cho ethanol ngập hết dƣợc liệu, thời gian ngõm là 1 tuần/lần rỳt dung dịch chiết, ngõm 3 lần (dịch đó nhạt màu). Dung dịch chiết thu đƣợc, đem cất thu hồi dung mụi ethanol và cụ cỏch thủy, thu đƣợc cao toàn phần (1192 g). Lấy 1000 g cao đem hũa tan một lƣợng vừa đủ 0,5 lớt ethanol 96%, và tiếp tục bổ xung thờm 1,5 lớt nƣớc cất để hũa tan. Sau đú lắc chiết với
n-hexan theo tỉ lệ 1:1 đến nhạt màu (5 lần), thu hồi dung mụi n-hexan đƣợc cao chiết n-hexan (cao H, 241,5 g). Phần dịch chiết cũn lại tiếp tục đem lắc, chiết với ethyl acetat theo tỉ lệ 1:1 đến nhạt màu (5 lần), cất thu hồi dung mụi ethyl acetat đƣợc cao chiết ethyl acetat (cao E, 640 g). Dung dịch chiết cũn lại đƣợc lắc chiết với n-butanol (5 lần), cất thu hồi n-butanol, ta thu đƣợc cao chiết n- butanol (cao B) Quy trỡnh chiết đƣợc túm tắt ở sơ đồ 3.1:
Sơ đồ 3.1: Sơ đồ chiết và phõn đoạn cao nụ vối
3.1.2 Phõn lập flavonoid chớnh trong cao phõn đoạn ethyl acetat
Để định hƣớng cho việc phõn lập, tiến hành thử định tớnh flavonoid trong cỏc cao H, cao E. Lấy 0,02g cao H, cao E hũa tan vào 10ml methanol ta đƣợc cỏc dung dịch H, E tƣơng ứng.
* Phản ứng tạo màu với FeCl3 5%: Lấy riờng 1 ml dung dịch H, E (ở
trờn) cho vào từng ống nghiệm sau đú cho vào mỗi ống nghiệm 1 giọt FeCl3 5% lắc và quan sỏt màu. Kết quả chỉ ra ở bảng 3.1.
Lắc chiết với n-butanol (làm lặp lại 5 lần)
Lắc chiết với ethyl acetat (làm lặp lại 5 lần) Lắc chiết với n-hexan (làm lặp lại 5lần)
Dung dịch ethy acetat Dung dịch nƣớc
Dung dịch n-butanol Dung dịch nƣớc Cao n- hexan Cao Ethyl Cao n- butanol Dung dịch nƣớc Cao tổng Dung dịch n-hexan Dung dịch nƣớc
* Phản ứng với NaOH 10%: Lấy riờng 1 ml dung dịch H, E (ở trờn) cho vào từng ống nghiệm sau đú cho vào mỗi ống nghiệm1 giọt NaOH 10% lắc và quan sỏt màu. Kết quả chỉ ra ở bảng 3.1
Bảng 3.1: Kết quả định tớnh sơ bộ flavonoid ở cao H và cao E
Mẫu Thuốc thử hiện màu
Dung dịch NaOH 10% Dung dịch FeCl3 5%
Cao H Khụng phản ứng Khụng phản ứng
Cao E Xuất hiện tủa màu vàng Dung dịch màu xanh đen
Qua kết quả định tớnh sơ bộ bảng 3.1 cho thấy trong phõn đoạn cao E cú chứa flavonoid, việc phõn lập một flavonoid chớnh đƣợc thực hiện từ cao E.
* Sắc ký cột:
Hũa một ớt cao phõn đoạn EtOAc trong methanol, tiến hành khảo sỏt bằng phƣơng phỏp SKLM để lựa chọn phƣơng phỏp chạy sắc ký cột phự hợp nhất, thử với một số hệ dung mụi Hx : ethyl acetat, Hx : cloroform…, kết quả khảo sỏt cho hệ dung mụi Hx : ethyl acetat là phự hợp nhất. Vỡ vậy tiến hành sắc ký cột với pha tĩnh là silica gel pha thuận cỡ hạt 40-63 àm, pha động là Hx : ethyl acetat với tỉ lệ tăng dần độ phõn cực.
* Chuẩn bị silica gel
Cõn khoảng 600g silica gel pha thƣờng cho vào cốc cú mỏ dung tớch 1000 ml, thờm n-hexan cho ngập bề mặt silica gel 4-5 cm, khuấy đều, cho bay hết khớ.
* Chuẩn bị cột sắc ký
Dựng cột thủy tinh trung tớnh cú đƣờng kớnh 10 cm, chiều dài 100 cm đƣợc lắp thẳng đứng trờn giỏ, phớa dƣới cột cú van điều chỉnh tốc độ chảy của
dung mụi. Lút một lớp bụng mỏng ở đỏy cột, ngay trờn van để chất nhồi sau khi đƣợc nhồi vào cột khụng gõy tắc. Đổ từ từ silica gel đó chuẩn bị ở trờn vào cột sao cho cột khụng bị rỗ, bề mặt cột phẳng và để yờn cho cột ổn định. Mở khúa cho dung mụi chảy và thờm n-hexan để ổn định cột.
* Chuẩn bị mẫu và đưa lờn cột
Cõn khoảng 300g cao phõn đoạn EtOAc hũa tan hoàn toàn bằng một lƣợng tối thiểu methanol, rồi đem mẫu đú tẩm với khoảng 100 g silica gel pha thƣờng. Sau đú đổ phần silica gel đó tẩm mẫu ra khay để bay hơi hết dung mụi, rồi đem sấy ở 50oC cho đến khụ. Nếu thấy vún cục thỡ cú thể dựng chày và cối sứ nghiền nhỏ để cú đƣợc hạt silica gel đó tẩm chất là mịn nhất. Sau khi chuẩn bị xong mẫu, đƣa mẫu từ từ vào cột sao cho khụng bị xỏo trộn lớp chất nhồi bờn trong cột, dựng pipet trỏng vũng quanh bờn trong cột trƣớc khi thờm dung mụi rửa giải.
* Tiến hành sắc ký cột
Tiến hành chạy cột với hệ dung mụi n-hexan: ethyl acetat với độ phõn cực tăng dần (tỉ lệ dung mụi từ 49:1 đến 1:1). Dựng bỡnh nún cú thể tớch 250 ml để hứng dung dịch ra khỏi cột, thu đƣợc 32 bỡnh (200 ml). Tất cả cỏc bỡnh hứng đều đƣợc kiểm tra bằng sắc ký lớp mỏng. Bằng cỏch này, ta thấy từ bỡnh 04 đến bỡnh 09 cho sắc đồ giống nhau cú 1 vết màu vàng (hỡnh 3.1), gộp cỏc bỡnh này lại, cất thu hồi dung mụi và cụ cỏch thủy đến khụ thu đƣợc chất rắn cú màu da cam, gọi là chất rắn CO-1(4,329 g). Khi kiểm tra lại bằng phƣơng phỏp SKLM pha thƣờng với 2 hệ dung mụi là : n-hexan:ethyl acetat (2:1), CHCl3:MeOH (20:1), và SKLM pha đảo với hệ dung mụi MeOH:nƣớc (20:1), chất rắn CO-1
a) Hỡnh ảnh SKLM b) Hỡnh ảnh chất CO-1
Hỡnh 3.1: Hỡnh ảnh SKLM và chất CO-1 phõn lập từ nụ vối
3.1.3. Xỏc định cấu trỳc chất phõn lập
Chất rắn CO-1 là tinh thể cú màu vàng da cam, cú điểm núng chảy 125- 1270C. Kiểm tra độ tinh khiết bằng mỏy sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) cho biết chất CO-1 phõn lập đƣợc cú độ tinh khiết 98,21% tớnh theo diện tớch pic, sắc ký đồ thể hiện ở hỡnh 3.2 Minutes 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 m AU 0 100 200 34016 1457 5242 1199 1875 691 2476 66 6412 2036 1009 2351 1201 15949 4250687 506 116 160 102 142 300 197 358 314 146 113 259 545 258 165 179 252 83 251 206 966 581 381 144 9: 341 nm, 8 nm nuvoistd
nu voi_stdCO55(0.11mg-ml)- 13042012 - 5uL -002.dat
Area
Phổ UV (MeOH) của chất CO-1 cho đỉnh hấp thụ cực đại ở λ= 340nm, nằm trong vựng hấp thụ mạnh của cỏc chalcon (300-400nm) [4] .
Hỡnh 3.3: Phổ tử ngoại (UV) chất CO-1
Phổ hồng ngoại cho đỉnh hấp thụ ở νmax = 3371 cm-1 đặc trƣng cho dao động húa trị của nhúm OH liờn kết hydro, đỉnh ở νmax =2938 cm-1 đặc trƣng cho dao động húa trị của liờn kết C-H, đỉnh ở νmax =1626 cm-1 đặc trƣng cho dao động húa trị của liờn kết C=O, đỉnh ở νmax =1537 cm-1 đặc trƣng cho dao động húa trị của liờn kết C=C, đỉnh ở νmax =1166 cm-1 đặc trƣng cho dao động húa trị của liờn kết C-O. Nhƣ vậy, trong cụng thức của hợp chất 1 cú nhúm –OH, nhúm C-O, nhúm C=O và liờn kết đụi C=C. (xem phụ lục)
Phổ 1
H-NMR (CD3OD, 500MHz) : cú độ dịch chuyển δ ppm: Cú 2 pic methyl (CH3, δH =2,076, s, và δH 2,13, s), 1 pic methoxy (OCH3, δH 3,64, s), một nhúm gồm 5 proton thuộc vũng thơm δH 7,405-7,453 và 7,652-7,671. Điều này khẳng định chất CO-1 cú vũng thơm. Hai proton cú độ dịch chuyển δH 8,02
(d) và δH 7,78 (d) cú hằng số tƣơng tỏc lớn (J=15,5 Hz), chứng tỏ chất CO-1 cú cấu hỡnh trans. (xem phụ lục).
Phổ 13
C-NMR (CD3OD, 125MHz) cú tất cả 18 tớn hiệu cho biết chất
CO-1 cú 18 nguyờn tử C. Cỏc tớn hiệu cho biết cú hai nhúm methyl (CH3) cú độ dịch chuyển δC 8,1 và 8,9 ppm, vỡ độ dịch chuyển của hai nhúm xuất hiện ở trƣờng cao độ nờn nú phải đƣợc gắn vào vũng thơm. Một nhúm methoxy (OCH3) cú δC 62,6 ppm, cũng gắn vào vũng thơm. Phổ 13C-NMR cũng cho biết cú 14 tớn hiệu cỏc bon của vũng thơm hoặc liờn kết đụi cú độ dịch chuyển từ δC 108,5 đến 163,1 ppm, và một nhúm keton (C=O) cú độ dịch chuyển δC 194,5 ppm. (xem phụ lục)
Kết hợp số liệu cỏc phổ UV, IR, 1
H-NMR và 13C-NMR cho thấy chất
CO-1 cú vũng thơm, cú nhúm C=O, nhúm OH, nhúm OCH3. Với việc cú 18 cỏc bon, nhƣng cú 3 cỏc bon đƣợc gắn vào vũng thơm chứng tỏ chất CO-1 cú khung gồm 15 cỏc bon, do đú sẽ là một flavonoid. Kết hợp phổ UV, phổ 1
H- NMR cho biết cú 2 proton cú cấu hỡnh trans, và phổ 13
C-NMR cho biết cú một nhúm C=O cú độ dịch chuyển ở trƣờng thấp chỳng tụi đi đến kết luận chất CO- 1 là một flavonoid thuộc nhúm chalcon. Kết hợp cỏc tài liệu tham khảo [11, 22], và cỏc dữ kiện phổ thu đƣợc chỳng tụi kết luận chất CO-1 là 2',4'- dihydroxy-6'-methoxy-3',5'-dimethylchalcon, cú CTPT là C18H18O4 và KLPT 298 amu. Phổ khối MS cho pic ion phõn tử ở [M+H]+, cú m/z = 299; ở [M-H]+ cú m/z = 297, tƣơng ứng với khối lƣợng phõn tử của chất rắn CO-1 là M = 298 amu.
Bảng 3.2: Số liệu phổ 1 H-NMR và 13C-NMR của chất CO-1 Vị trớ Số liệu NMR 13 C-NMR δC (ppm) 1 H-NMR δH (ppm) (mult, J in Hz) 1 136,8 - 2 129,3 7,67 (dd, J = 8, J=1,5 Hz) 3 130,0 7,42 (m) 4 131,2 7,41 (m) 5 130,0 7,43 (m) 6 129,3 7,67 (dd, J =8, J=1,5 Hz) C=O 194,5 - Α 128,2 7,79 (d, J = 15,5 Hz) Β 143,5 8,03 (d, J = 15,5 Hz) 1′ 109, 4 - 2′ 162,6 - 3′ 108,5 - 4′ 163,1 - 5′ 111,4 - 6′ 160,2 - 3′-CH3 8,1 2,08 (s) 5′-CH3 8,9 2,13 (s) OCH3 62,6 3,64 (s)
Từ cỏc dữ liệu giải phổ IR, UV, 1
H-NMR, 13C-NMR và cỏc số liệu đƣợc trỡnh bày ở bảng 3.1 đó khẳng định chắc chắn cụng thức phõn tử của hợp chất này. Cụng thức cấu tạo của chất CO-1 đƣợc trỡnh bày trong hỡnh 3.4.
Hỡnh 3.4: Cụng thức cấu tạo chất CO-1
Nhƣ vậy flavonoid chớnh tỏch đƣợc trong nụ vối là 2′,4′-dihydroxy- 6′methoxy-3′,5′-dimethylchalcone (ký hiệu ngắn gọn là CO-1). Đƣợc xỏc định thụng qua cảm quan, cỏc phổ hồng ngoại (IR), phổ cộng hƣởng từ hạt nhõn (1H và 13C NMR), khối phổ (MS) khi so sỏnh với cỏc tài liệu tham khảo [14, 27]. Kiểm tra độ tinh khiết bằng HPLC, đo nhiệt độ núng chảy của CO-1 nhiều lần đều cho kết quả ổn định ở 125-127oC. Nhƣ vậy, cú thể sử dụng mẫu chất CO-1
phõn lập đƣợc làm chất đối chiếu trong phộp xõy dựng phƣơng phỏp định tớnh, định lƣợng flavonoid và chất này trong cỏc mẫu nụ và lỏ vối.
3.2 Xõy dựng phƣơng phỏp định tớnh flavonoid trong lỏ và nụ vối 3.2.1 Định tớnh bằng phản ứng húa học 3.2.1 Định tớnh bằng phản ứng húa học
Lấy 2 g bột dƣợc liệu (nụ, lỏ vối) cho vào bỡnh nún, chiết siờu õm với 20ml ethanol 900 trong 30 phỳt, lọc lấy dịch lọc. Dựng dịch lọc để làm cỏc phản ứng định tớnh.
Nhỏ vài giọt dung dịch chiết lờn miếng giấy lọc, để khụ rồi hơ lờn miệng lọ amoniac đặc, quan sỏt sự thay đổi màu của vết chất thấy vết chất chuyển từ vàng sang vàng đậm.
Kết luận: Cú flavonoid
Phản ứng với kiềm loóng.
Cho 2ml dịch chiết vào ống nghiệm, nhỏ vài giọt dung dịch natri hydroxid 10%, lắc, dung dịch trong ống nghiệm chuyển màu vàng, sau xuất hiện tủa vàng.
Kết luận: Cú flavonoid
Phản ứng cyanidin (phản ứng Shinoda).
Cho 2ml dịch chiết vào ống nghiệm, thờm ớt bột magie kim loại, rồi nhỏ từ từ vài giọt dung dịch acid hydroclorid đậm đặc. Sau vài phỳt dung dịch xuất hiện màu hồng.
Kết luận: Cú flavonoid
Phản ứng với dung dịch sắt(III) clorid 5%.
Cho 2ml dịch chiết vào ống nghiệm, thờm vài giọt dung dịch sắt(III)clorid 5%, lắc sẽ xuất hiện màu xanh đen.
Kết luận: Cú flavonoid
Dựa trờn cỏc tài liệu tham khảo, cỏc cụng trỡnh nghiờn cứu định tớnh flavonoid của cỏc nhà khoa học ở cỏc Trƣờng đại học, cỏc Viện nghiờn cứu ở trong nƣớc và trờn thế giới. Trong luận văn này khẳng định lại một lần nữa cỏc hợp chất vụ cơ nhƣ NH3, NaOH, FeCl3…luụn là những thuốc thử cho phản ứng rất nhạy, tạo màu đặc trƣng cho việc phỏt hiện flavonoid trong thực vật.
3.2.2 Định tớnh bằng TLC
a) Chuẩn bị mẫu chấm sắc ký
Dung dịch thử: Lấy 1 gam bột dƣợc liệu (nụ, lỏ vối) cho vào bỡnh nún, thờm 50 ml methanol (MeOH) rồi đem siờu õm 30 phỳt, lọc qua giấy lọc, dịch lọc để làm cỏc phộp định tớnh.
Dung dịch đối chiếu: Dung dịch flavonoid chớnh (tỏch đƣợc ở nụ vối)
trong MeOH (hàm lƣợng khoảng 1 mg/ml).
Đƣa chất phõn tớch lờn bản mỏng: Lƣợng mẫu cần đƣa lờn bản mỏng là khoảng 10 μl dung dịch đó pha ở trờn. Cỏc vết chấm cựng trờn một đƣờng xuất phỏt cỏch mộp dƣới của bản mỏng 1,5 cm, đƣờng kớnh vết chấm 3-5 mm và cỏch nhau 15 mm, hai vết chấm ngoài cựng của bản mỏng cỏch mộp ngoài khoảng 1cm.
b) Hệ dung mụi sắc ký: Tiến hành khảo sỏt triển khai sắc ký cho cỏc hệ
dung mụi sau: Hệ 1: Toluen:EtOAc:Aceton:Acid formic =5:2:2:1 (v:v:v )
Hệ 2: EtOAc:Acid acetic:Acid formic:Nƣớc =10:1:1:2 (v:v:v:v ) Hệ 3: n-Hexan : EtOAc : Acid formic =6:3:0,1 (v:v:v )
Hệ 4: EtOAc : Toluen : Acid formic : Nƣớc = 7:3:1,5:1 (v:v:v) Tiến hành triển khai sắc ký lỏ, nụ vối và chất rắn CO-1. Qua khảo sỏt cỏc hệ dung mụi ở trờn, chỳng tụi thấy với hệ 3 cho kết quả sắc ký đồ tỏch tốt nhất (hỡnh 3.5A) nờn dựng hệ 3 làm hệ dung mụi khai triển.
Tiến hành triển khai chạy sắc ký dịch chiết của nụ, lỏ và chất đối chiếu
CO-1 trờn cựng bản mỏng. Sau đú chỳng tụi tiến hành soi ở cỏc bƣớc súng UV- 254 nm, UV-366 nm và ỏnh sỏng trắng.
Hỡnh 3.5A: Sắc ký đồ định tớnh flavonoid trong nụ và lỏ vối
C: Chất chuẩn CO-1 N: Nụ vối L: Lỏ vối A: UV-254nm
B: Ánh sỏng trắng (trƣớc khi phun thuốc thử) C: UV- 366nm
D: Ánh sỏng trắng (sau khi phun thuốc thử) E: UV-366 sau khi phun thuốc thử
Cỏc sắc ký đồ hỡnh (A,B,C) cho thấy flavonoid trong nụ, lỏ vối cho cỏc vết màu đen xỏm khi soi dƣới UV-254 nm và UV-366 nm. Sau khi phun thuốc thử H2SO4 10%/ethanol và sấy ở 1050C, ở miền ỏnh sỏng trắng cho cỏc vết cú màu vàng (Rf =0,47) đặc trƣng của flavonoid.
Với thuốc thử acid boric/acid oxalix với tỷ lệ 2:1 cho ta kết quả sắc ký đồ ở hỡnh D, E nhƣ sau: Cũng cho một vệt xỏm đen khi soi ở bƣớc súng UV-366 nm, Sau khi sấy ở 1050C cho ta một vết màu vàng (Rf = 0,47) đặc trƣng của flavonoid.
Nhƣ vậy cú thể sử dụng hệ 3 làm hệ dung mụi cho việc triển khai sắc ký để định tớnh flavonoid trong việc xõy dựng tiờu chuẩn cơ sở cho dƣợc liệu nụ, lỏ vối.
a) Chuẩn bị dịch chấm sắc ký: hũa tan một ớt cao đặc nụ vối và cao phõn đoạn EtOAc trong MeOH.
Dựng bản mỏng silica gel 60F254 đó trỏng sẵn và hoạt húa ở 110oC/ 60 phỳt.
b) Hệ dung mụi khai triển:
Hệ 1: Toluen : EtOAc : Aceton : Acid formic = 5:2:2:1 (v:v:v ) Hệ 2: EtOAc : Acid acetic : Acid formic : Nƣớc = 10:1:1:2 (v:v:v ) Hệ 3: Toluen : EtOAc : Acid formic = 6:4:1 (v:v:v )
Hệ 4: EtOAc : Toluen : Acid formic : Nƣớc = 7:3:1,5:1 (v:v:v ) Qua khảo sỏt cỏc hệ dung mụi khỏc nhau, hệ dung mụi 3 cho kết quả tỏch cỏc chất cú trong cao EtOAC của nụ vối là tốt nhất. Cho nờn dựng hệ 3 làm hệ dung mụi khai triển và kết quả đƣợc trỡnh bày ở hỡnh 3.5B và bảng 3.3.
A B C D
Hỡnh 3.5B: Sắc ký đồ định tớnh flavonoid trong cao ETOAC
1: Cao tổng nụ vối. 2: Cao phõn đoạn EtOAc nụ vối (A). Quan sỏt ở UV 254nm (B).Quan sỏt ở UV 365nm
Bảng 3.3. Kết quả SKLM cao phõn đoạn EtOAc TT Rf x 100 Màu sắc UV 254 nm UV 365 nm AS thƣờng (Hơ amoniac) AS thƣờng H2SO4/cồn
1 89,7 Nõu đậm Lam đậm Cam nhạt Nõu nhạt
2 76,9 Nõu nhạt Xanh nhạt Tớm đậm
3 69,2 Nõu nhạt Xanh nhạt Tớm nhạt
4 64,1 Nõu đậm Xanh sỏng Tớm nhạt
5 53,8 Nõu đậm Xanh sỏng Tớm nhạt
6 46,1 Nõu nhạt Lam nhạt Tớm nhạt
7 39,2 Nõu nhạt Nõu nhạt Nõu nhạt
8 37,2 Nõu nhạt
9 24,4 Nõu nhạt Lam nhạt Nõu nhạt
10 19,2 Nõu nhạt Xanh sỏng Tớm nhạt Tớm nhạt
Trờn sắc ký đồ cho thấy ở UV-254 nm, UV-365 nm và sau khi nhỳng H2SO4 10%/ cồn, cao phõn đoạn EtOAc cú 10 vết cú Rf và màu sắc tƣơng đƣơng với cao đặc nụ vối. Khi hơ amoniac thỡ cao đặc nụ vối và cao phõn đoạn