silica gel Merck DC-Alufolien 60 F254 có chiều dày 0,2 mm trên nền nhôm.
Thuốc thử hiện màu là dung dịch vanilin/H2SO4 đặc 1%, bản mỏng sau khi phun thuốc thử đƣợc hơ nóng ở 120 oC hoặc thuốc thử Dragendorff.
3.4.1 Phân tích phần chiết n-hexan (CTH)
Hệ dung môi triển khai cho sắc ký lớp mỏng phần chiết n-hexan là n-hexan- axeton với tỷ lệ 19:1 và 3:1 (v/v).
Kết quả phân tích TLC phần chiết n-hexan cành nhỏ cây Khổ sâm Bắc Bộ (CTH) đƣợc trình bày ở Bảng 2.
Bảng 2: Phân tích TLC phần chiết n-hexan (CTH) Hệ dung môi
n-hexan-axeton
STT Rf Dạng vệt Hiện màu
(vanilin/H2SO4)
19:1
1 0,90 Tròn Tím
2 0,80 Tròn Tím hồng
3 0,57 Tròn Tím
4 0,50 Tròn Tím
5 0,27 Tròn Tím hồng
3:1
1 0,93 Tròn Tím
2 0,70 Tròn Tím
3 0,60 Tròn Tím hồng
4 0,40 Tròn Tím
5 0,27 Tròn Tím
3.4.2 Phân tích phần chiết điclometan (CTD)
Hệ dung môi triển khai cho sắc ký lớp mỏng phần chiết điclometan là n- hexan-axeton với các tỷ lệ khác nhau 19:1, 12:1, 9:1 và 3:1 (v/v).
Kết quả phân tích TLC phần chiết điclometan cành nhỏ cây Khổ sâm Bắc Bộ (CTD) đƣợc trình bày ở Bảng 3.
Bảng 3: Phân tích phần chiết điclometan (CTD) Hệ dung môi
n-hexan-axeton
STT Rf Dạng
vệt
Hiện màu (vanilin/H2SO4)
19:1
1 0,90 Tròn Tím
2 0,80 Tròn Tím hồng
3 0,57 Tròn Tím
4 0,50 Tròn Tím
5 0,27 Tròn Tím hồng
12:1
1 0.85 Tròn Tím
2 0,76 Tròn Tím hồng
3 0,61 Tròn Tím
4 0,53 Tròn Tím
5 0,21 Tròn Tím hồng
9:1
1 0,90 Tròn Tím
2 0,80 Tròn Tím
3 0,57 Dài Tím
4 0,33 Tròn Tím hồng
3:1
1 0,93 Tròn Tím
2 0,70 Tròn Tím
3 0,60 Tròn Tím hồng
4 0,40 Tròn Tím
5 0,27 Tròn Tím
3.4.3 Phân tích phần chiết etyl axetat (CTE)
Hệ dung môi triển khai TLC phần chiết etyl axetat là điclometan-metanol với tỷ lệ 19:1 và 9:1 (v/v).
Kết quả phân tích TLC phần chiết etyl axetat cành nhỏ cây Khổ sâm (CTE) đƣợc trình bày ở Bảng 4.
Bảng 4: Phân tích phần chiết etyl axetat (CTE) Hệ dung môi
CH2Cl2-MeOH
STT Rf Dạng vệt Hiện màu
( vanilin/H2SO4)
19:1
1 0,97 Tròn Tím
2 0,85 Tròn Tím
3 0,58 Tròn Tím
4 0,36 Tròn Tím đậm
5 0,18 Tròn Tím đậm
9:1
1 0,95 Tròn Tím
2 0,88 Tròn Tím
3 0,58 Tròn Tím đậm
4 0,48 Tròn Tím đậm
3.5 PHÂN TÁCH CÁC PHẦN CHIẾT VÀ PHÂN LẬP CÁC HỢP CHẤT
3.5.1 Phân tách phần chiết n-hexan (CTH)
Phần chiết n-hexan (15 g) được phân tách bằng sắc ký cột thường (CC) trên silica gel (Merck, 63-200 àm). Mẫu được đưa lờn cột theo phương phỏp tẩm mẫu trên silica gel. Rửa giải sắc ký với n-hexan và hệ dung môi gradient n-hexan-axeton
với các tỷ lệ 49:1, 29:1, 19:1, 12:1, 9:1, 3:1 và 2:1 (v/v) đƣợc 31 phân đoạn, mỗi phân đoạn 100 ml. Các phân đoạn có sắc ký đồ TLC giống nhau đƣợc gộp lại và cất loại dung môi dưới áp suất giảm cho 9 nhóm phân đoạn CTH1 (các phân đoạn 1-6), CTH2 (7-11), CTH3 (12-15), CTH4 (16-17), CTH5 (18-21), CTH6 (22-25), CTH7 (26-28), CTH8 (29-31) và CTH9 (32-34).
Nhóm phân đoạn CTH3 (2,6 g) đƣợc rửa bằng n-hexan cho các tinh thể hình kim màu trắng CTH3 (chất I) (0,41 g).
Nhóm phân đoạn CTH5 (5,06 g) đƣợc rửa bằng n-hexan sau đó rửa với hệ dung môi n-hexan-axeton 5:1, sau đó kết tinh lại trong axeton cho các tinh thể hình kim không màu CTH5 (chất II) (27 mg).
Dịch rửa của nhóm phân đoạn CTH5 đƣợc tinh chế bằng sắc kí cột nhanh (FC) gradient trên silica gel với n-hexan và n-hexan-axeton 19:1, 12:1, 9:1, 5:1 và 3:1. Các phân đoạn cho sắc ký đồ TLC giống nhau đƣợc gộp lại thành 4 nhóm phân đoạn từ CTH5.1 đến CTH5.4. Nhóm phân đoạn CTH5.2 (0,43 g) đƣợc rửa bằng n- hexan-axeton, sau đó đƣợc kết tinh lại trong axeton cho tinh thể hình kim không màu CTH5.2. Phân tích TLC và co-TLC cho thấy chất CTH5.2 là chất II (33 mg).
Nhóm phân đoạn CTH6 (2,02 g) đƣợc tinh chế bằng Mini-C trên silica gel (40-63 àm) với hệ dung mụi gradient n-hexan-axeton 4:1, 3:1 và 1:1. Qua phõn tích TLC các phân đoạn đƣợc gộp thành 5 nhóm phân đoạn từ CTH6.1 đến CTH6.5.
Nhóm phân đoạn CTH6.4 đƣợc rửa với hệ dung môi n-hexan-axeton, sau đó kết tinh lại trong hệ dung môi điclometan-axeton cho tinh thể hình kim màu trắng CTH6.4 (chất III) (15 mg).
Nhóm phân đoạn CTH9 đƣợc rửa bằng MeOH cho chất bột màu trắng, khó tan trong các loại dung môi CTH9 (chất IV) (73,4 mg).
Quá trình phân tách phần chiết n-hexan đƣợc trình bày trong Sơ đồ 2, Mục 4.3, Chương 4: Kết quả và Thảo luận.
3.5.2 Phân tách phần chiết điclometan (CTD)
Phần chiết điclometan (CTD) (9 g) đƣợc phân tách bằng sắc ký cột (CC) trên silica gel (Merck, 0,063-0,2 mm), kích thước cột 2 x 30 cm. Mẫu được đưa lên cột theo phương pháp tẩm mẫu trên silica gel. Rửa giải sắc ký với n-hexan và hệ dung môi gradient n-hexan-axeton 27:1, 19:1, 12:1, 9:1, 6:1 và 3:1 (v/v) cho 67 phân đoạn, mỗi phân đoạn 20 ml. Các phân đoạn có TLC giống nhau đƣợc gộp lại và cất loại dung môi dưới áp suất giảm cho 6 nhóm phân đoạn CTD1 (các phân đoạn 2-6), CTD2 (7-15), CTD3 (16-26), CTD4 (27-41), CTD5 (42-58) và CTD6 (59-67).
Nhóm phân đoạn CTD1 (0,9 g) đƣợc rửa bằng n-hexan để loại bớt dầu, sau đú đƣợc tinh chế nhiều lần bằng Mini-C trờn silica gel cỡ hạt 40-63 àm, rửa giải với n-hexan và hệ dung môi n-hexan-axeton 49:1, 19:1, 9:1, 6:1 và 3:1 cho các chất CTD1.1 (chất V) (7,5 mg) và CTD1.2 (chất VI) (5 mg) dưới dạng tinh thể màu trắng.
Nhóm phân đoạn CTD2 (0,86 g) đƣợc rửa bằng n-hexan cho các tinh thể hình kim màu trắng CTD2 (0,47 g). Phân tích TLC và co-TLC cho thấy chất này là chất I đƣợc phân lập từ CTH3.
Nhóm phân đoạn CTD4 (0,65 g) đƣợc rửa bằng n-hexan và hệ dung môi n- hexan-axeton sau đó đƣợc kết tinh lại trong axeton cho các tinh thể hình kim không màu CTD4 (0,21 g). Phân tích TLC cho thấy các tinh thể này là chất II đã đƣợc phân lập từ nhóm phân đoạn CTH5.
Nhóm phân đoạn CTD5 (1,5 g) đƣợc tinh chế trên silica gel cỡ hạt 40-63 àm, rửa giải với hệ dung mụi gradient n-hexan-axeton. Dựa trờn phõn tích TLC cỏc phân đoạn có sắc kí đồ giống nhau đƣợc gộp lại cho 5 nhóm phân đoạn từ CTD5.1 đến CTD5.5. Nhóm phân đoạn CTD5.2 (0,18 g) đƣợc rửa với hệ dung môi n- hexan-axeton cho các tinh thể hình kim màu trắng CTD5.2.1 (chất VII) (2 mg).
Phần dịch rửa tiếp tục đƣợc tinh chế tiếp bằng Mini-C trên silica gel cỡ hạt 15-40 àm, với hệ dung mụi gradient điclometan-axeton 19:1, 12:1, 9:1, 6:1 và 4:1 cho 2
chất là CTD5.2.1 (VII) (2,8 mg) và CTD5.2.2 (5 mg). So sánh TLC và co-TLC cho thấy CTD5.2.2 là chất III đƣợc phân lập từ CTH6.
Nhóm phân đoạn CTD6 (4,06 g) đƣợc rửa bằng MeOH, sau đó đƣợc tinh chế Mini-C trờn silica gel 40-63 àm, hệ dung mụi gradient n-hexan-axeton 3:1, 2:1 và 1:1 cho chất bột màu trắng là CTD6 (54 mg). So sánh TLC cho thấy CTD6 là chất IV nhận đƣợc ở phân đoạn CTH9.
Quá trình phân tách phần chiết điclometan đƣợc trình bày trong Sơ đồ 2, Mục 4.3, Chương 4: Kết quả và Thảo luận.
3.5.3 Phân tách phần chiết etyl axetat (CTE)
Phần chiết etyl axetat (CTE) (1 g) đƣợc phân tách bằng sắc ký cột CC trên silica gel (Merck, 63-200 μm). Mẫu được đưa lên cột theo phương pháp tẩm mẫu trên silica gel. Rửa giải với CH2Cl2 và hệ dung môi gradient CH2Cl2-MeOH 29:1, 19:1, 9:1, 3:1, 2:1 và 1:1 (v/v) cho 35 phân đoạn, mỗi phân đoạn 20 ml. Các phân đoạn có TLC giống nhau được gộp lại và được cất loại dung môi dưới áp suất giảm cho 4 nhóm phân đoạn CTE1 (các phân đoạn 1-9), CTE2 (10-15), CTE3 (16-28) và CTE4 (29-35).
Nhóm phân đoạn CTE2 (0,17 g) đƣợc rửa bằng MeOH cho chất bột vô định hình màu trắng là CTE2 (8 mg). So sánh TLC cho thấy CTE2 là chất IV nhận đƣợc ở phân đoạn CTH9 và CTD6.
Quá trình phân tách phần chiết etyl axetat đƣợc trình bày trong Sơ đồ 2, Mục 4.3, Chương 4: Kết quả và Thảo luận.
3.5.4 Phân tách phần chiết nước (CTW1)
Phần chiết nước (CTW) được phân tách gradient bằng cột CC trên nhựa polyme Dianion HP-20 với H2O, 20%, 40%, 60% MeOH-H2O và MeOH cho các phân đoạn tương ứng kí hiệu CTW1, CTW2 và CTW3.
Sắc ký lớp mỏng các phân đoạn cho thấy CTW1 có khả năng phân giải với
Kết quả phân tích TLC phần chiết CTW1 cành nhỏ cây Khổ sâm đƣợc trình bày ở Bảng 5.
Bảng 5: Phân tích TLC phần chiết nước (CTW1) Hệ dung môi
EtOAc-H2O-HCOOH
STT Rf Dạng vệt Hiện màu
(vanilin/H2SO4)
17:3:2
1 0,78 Tròn Tím
2 0,39 Tròn Tím
3 0,26 Tròn Tím đen
4 0,12 Tròn Tím hồng
10:3:2
1 0,88 Tròn Tím
2 0,56 Dài Tím
3 0,41 Tròn Tím hồng
Phân đoạn 20% MeOH-H2O (CTW1) (2,5 g) đƣợc phân tách bằng sắc ký cột (CC), kích thước 2 x 25 cm trên silica gel (Merck, cỡ hạt 63-200 μm). Mẫu được đưa lên cột theo phương pháp tẩm mẫu trên silica gel. Rửa giải bằng CH2Cl2 và hệ dung môi gradient điclometan-metanol với các tỷ lệ 19:1, 12:1, 9:1, 6:1 và 4:1 (v/v) cho 48 phân đoạn, mỗi phân đoạn 20 ml. Các phân đoạn có TLC giống nhau đƣợc gộp lại và cất loại dung môi dưới áp suất giảm cho 6 nhóm phân đoạn CTW1.1 (các phân đoạn 1-8), CTW1.2 (9-10), CTW1.3 (11-14), CTW1.4 (25-27), CTW1.5 (28- 40) và CTW1.6 (41-48).
Nhóm phân đoạn CTW1.4 đƣợc rửa với MeOH, cho tinh thể hình kim màu trắng là CTW1.4 (18 mg) (chất VIII).
Quá trình phân tách phần chiết nước (CTW1) được trình bày trong Sơ đồ 2, Mục 4.3, Chương 4: Kết quả và Thảo luận.
3.6 HẰNG SỐ VẬT LÝ VÀ DỮ KIỆN PHỔ CỦA CÁC HỢP CHẤT