Chương 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU4.1 ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU
4.4 CẤU TRÚC CỦA CÁC HỢP CHẤT ĐƢỢC PHÂN LẬP
Từ các phần chiết cành nhỏ cây Khổ sâm Bắc Bộ các hợp chất β-sitosterol (I) (CTH3 và CTD2), ent-7β-hydroxy-15-oxokaur-16-en-18-yl acetat (II) (CTH5 và CTD4), asperglaucid (III) (CTH6 và CTD5.2.2), β-sitosterol-3-O-β-D- glucopyranosid (IV) (CTH9, CTD6 và CTE2), acid acetyl aleuritolic (V) (CTD1.1), acid stearic (VI) (CTD1.2), ent-1α-acetoxy-7β,14α-dihydroxykaur-16- en-15-on (VII) (CTD5.2.1) và acid glucosyringic (VIII) (CTW1.4) đã đƣợc phân lập.
β-Sitosterol (I)
Hợp chất I được phân lập dưới dạng tinh thể hình kim, màu trắng, đ.n.c. 135- 136 oC, Rf = 0,44 (TLC, silica gel, n-hexan-EtOAc 4:1, v/v), hiện màu tím với thuốc thử vanilin/H2SO4 đặc 1%.
Hợp chất này đƣợc nhận dạng trên cơ sở so sánh TLC và co-TLC với chất chuẩn β-sitosterol.
HO
19
18
1 2 3
4 5
6 7
8 9 10
11 12
13
27 14
15 16 17
20 21
22
23 24 28
29
25 26
I
Ent-7β-Hydroxy-15-oxokaur-16-en-18-yl acetat (II)
Hợp chất II được phân lập dưới dạng tinh thể hình kim, không màu, đ.n.c.
132-135 oC, Rf = 0,5 (TLC, silica gel, n-hexan-axeton 3:1, v/v), hiện màu tím với thuốc thử vanilin/ H2SO4 đặc 1% và hiện màu da cam với thuốc thử Dragendorff.
Hợp chất này đƣợc nhận dạng dựa trên cơ sở so sánh TLC, co-TLC và HPLC phân tích với chất chuẩn ent-7β-hydroxy-15-oxokaur-16-en-18-yl acetat.
II Asperglaucid (III)
Hợp chất III được phân lập dưới dạng tinh thể hình kim màu trắng, đ.n.c.
185-187 oC, Rf = 0,79 (TLC, silica gel, điclometan-axeton 9:1, v/v), hiện màu xanh đen với thuốc thử Dragendorff và không hiện màu với thuốc thử vanilin/H2SO4 đặc 1%.
III
Phổ EI-MS của chất III cho pic ion phân tử ở m/z 444, cho giả thiết một công thức phân tử dự kiến C27H28O4N2 phù hợp với dữ kiện phổ 1H-NMR và 13C- NMR.
Phổ 1H-NMR, 13C-NMR và DEPT của III cho thấy sự có mặt của hai nhóm amid bậc 2 ở δ 6,76 (1H, d, J = 7,5 Hz) và 5,94 (1H, d, J = 8,5 Hz); hai nhóm
cacbonyl amid (–CO–NH–) ở δC 170,3 (s) và 167,1 (s). Ngoài ba vòng benzen thế 1 lần [δH 7,71 (2H, d, J = 8,5 Hz), 7,52 (1H, t, J = 8,5 Hz), 7,43 (2H, t, J = 8,5 Hz), 7,26 (2H, m), 7,26 (3H, m), 7,15 (3H, m), 7,07 (2H, d, J = 8,3 Hz); δC 136,7 (s), 136,6 (s), 133,7 (s), 131,9 (d), 129,3 (2d), 129,1 (2d), 128,8 (2d), 128,7 (2d), 128,6 (2d), 127,2 (d), 127,1 (2d), 126,8 (d)], hai nhóm –CH2-CH(NH)- [δH 4,76 (1H, m), 4,34 (1H, m), 3,21 (1H, dd, J = 13,5 Hz), 3,06 (1H, dd, J = 13,5 Hz), 2,75 (2H, m)] còn một nhóm thế đáng chú ý khác là acetoxymetyl [δH 3,92 Hz (dd, J = 5,0 Hz, 11,0 Hz), 3,81 (dd, J = 4,5 Hz, 11,0 Hz) và 2,02 (s); δC 64,6 (t), 170,7 (s) và 20,8 (q)].
Do đó trên cơ sở dữ kiện phổ MS và NMR cấu trúc của III đƣợc xác định là asperglaucid - một dipeptit có khả năng chống dị ứng, đã đƣợc phân lập từ một loài Euphorbiaceae, Pteris multifida Poir (Pteridaceae) và từ Mucura cinerra [27, 30].
β-Sitosterol-3-O-β-D-glucopyranosid (IV)
Hợp chất này được phân lập dưới dạng bột vô định hình màu trắng, đ.n.c.
281-283 oC, Rf = 0,41 (TLC, silica gel, n-hexan-axeton 1:1, v/v), Rf = 0,53 (TLC, silica gel, điclometan-metanol 6:1, v/v) và hiện màu tím với thuốc thử vanilin/H2SO4 đặc 1%.
GlcO
19
18
1 2 3
4 5
6 7 8 9 10
11 12
13
27 14
15 16 17
20 21
22
23 24 28
29
25 26
IV
Phổ 1H-NMR của IV cho giả thiết về sự liên quan của hợp chất này với β- sitosterol. Các tín hiệu của hai nhóm metyl bậc ba [H 0,66 (3H, s, 19-Me) và 0,96 (3H, s, 18-Me)], một nhóm metyl bậc hai [δH 0,90, (3H, d, J = 6,5 Hz, 21-Me)], một
[δH 0,83 (3H, d, J = 7,0 Hz, 26-Me) và 0,82 (3H, d, J = 7,0 Hz, 27-Me)]; các nhóm sau này thuộc về một mạch nhánh 1-metyl-4-etyl-5-metylhexyl của một khung stigmastan. Một nối đôi thế ba lần [δH 5,32 (1H, br s, H-6); δC 121,0 (d, C-6), 140,4 (s, C-5)] là dấu hiệu nhận biết của một khung stigmast-5-en của một dẫn xuất của β- sitosterol; sự dịch chuyển về phía trường thấp được phát hiện cho các tín hiệu proton và cacbon 13 cho thấy đây có thể là một dẫn xuất của β-sitosterol ở vị trí C- 3. Khi so sánh tổng số các tín hiệu cacbon trên phổ 13C-NMR của IV (35C) với của β-sitosterol (29C) chúng ta sẽ thấy khả năng xuất hiện một hexozơ khẳng định cho cấu trúc một glycozit của IV. Tín hiệu của proton anomeric [δH 4,23 (1H, d, J = 7,5 Hz, H-1')] và cacbon anomeric δC 100,7 (d, C-1') và các tín hiệu 13C-NMR khác nhau ở δC 61,0 (t, C-6'), 70,1 (d, C-4’), 73,4 (d, C-2'), 76,9 (d, C-5') và 76,6 (d, C-3') cho thấy hexozơ này phải là β-glucopyranosid. Nhóm metin cacbinol ở C-3 có sự định hướng β dựa trên độ chuyển dịch hóa học ở δC 76,7 của C-3. Cấu hình D của β- glucopyranosid đƣợc giả thiết từ sự xuất hiện chủ yếu của nó trong các sterol glycosid thiên nhiên.
Trên cơ sở của các phân tích phổ NMR, cấu trúc của IV đƣợc xác định là β- sitosterol 3-O-β-D-glucopyranosid.
Acid acetyl aleuritolic (V)
Hợp chất V được phân lập dưới dạng tinh thể hình kim màu trắng, đ.n.c.
273-275 oC, Rf = 0,49 (TLC, silica gel, n-hexan-axeton 6:1, v/v), hiện màu tím với thuốc thử vanilin/H2SO4 đặc 1%.
COOH
AcO
1 2
3 4
5
6 7 8 9
10 11
12
13
14 15
16 17 18
19 20
21
22
23 24
25 26
30 29
28 27
V
Phổ 1H-NMR của V cho biết sự có mặt của 7 nhóm metyl ở dạng singlet [δH 0,85 (3H, s), 0,88 (3H, s), 0,91 (3H, s), 0,92 (3H, s), 0,94 (3H, s), 0,95 (3H, s), 0,96 (3H, s)], một nhóm acetyl ở δH 2,04 (3H, s), một nối đôi thế 3 lần [δH 5,52 (1H, dd, J = 8,0 Hz, 3,0 Hz)] và một nhóm oxymetin [δH 4,46 (1H, dd, J = 11,0 Hz, 5,0 Hz)]. Sự chuyển dịch vể phía trường thấp của nhóm oxymetin cho thấy có nhóm acetoxy liên kết với nhóm oxymetin này. Phổ 13C-NMR và DEPT khẳng định các dữ kiện phổ 1H-NMR về cấu trúc của một tritecpenoit năm vòng với 7 nhóm metyl [δC 15,6 (q), 16,6 (q), 22,4 (q), 26,2 (q), 27,9 (q), 28,7 (q) và 31,9 (q)], một nối đôi thế 3 lần [δC 160,6 (s) và 116,8 (d)], một nhóm oxymetin chuyển dịch về phía trường thấp [δC 80,9 (d)], một nhóm acid cacboxylic [δC 184,0 (s)]. Nhóm acetoxy đã được xác định bằng các tín hiệu cộng hưởng ở δC 170,9 (s) và 21,3 (q).
Trên cơ sở các dữ kiện phổ 1H-NMR, 13C-NMR và DEPT một cấu trúc taraxer-14-en đã đƣợc xác định cho chất V. Các tra cứu tài liệu đã xác định đƣợc nhóm acid cacboxylic ở C-28 [23]. Nhóm oxymetin đƣợc giả thiết là ở vị trí C-3 trên cơ sở sự sinh tổng hợp các triterpenoit từ squalen 2,3-epoxid, nhóm acetoxy cũng đã được xác định là liên kết với vị trí này từ sự chuyển dịch về phía trường thấp của H-3 (δH 4,46) và C-3 [δC 80,9 (d)].
Hóa lập thể 3β của nhóm acetoxy đã được xác định dựa trên hằng số tương tác Jax-ax = 11,0 Hz của H-3α. Do đó, chất V đƣợc xác định là acid acetyl aleuritolic phự hợp với cỏc dữ kiện phổ của chất này đó đƣợc phõn lập từ vỏ và lừi gỗ cõy Homonoia riparia [53]. .
Acid 3β-hydoxytaraxer-14-en-28-oic (axit aleuritolic) lần đầu tiên đƣợc phân lập từ cây Chẩu (Aleurites montana, Euphorbiaceae) và đƣợc tìm thấy trong nhiều loài của họ Euphorbiaceae [7]. Acid aleuritolic cũng đƣợc phát hiện trong một số thực vật chi Croton L., Euphorbiaceae. Theo L. P. Peres [35] hoạt tính kháng S.
aureus và S. typhimurium của acid acetyl aleuritolic ở giá trị nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) là 1 mg/ml.