Trong một bài thuốc dân gian, lá Khổ sâm dưới dạng nước sắc hoặc siro đã đƣợc sử dụng để điều trị bệnh nhân sốt rét gây ra bởi Plasmodium falciparum và P.
vivax. Thuốc thể hiện rừ tỏc dụng ức chế kí sinh trựng sốt rột và hạ sốt và khụng cú những biểu hiện độc tính, tuy nhiên so với các thuốc tổng hợp thì tác dụng còn thấp và lƣợng thuốc dùng còn nhiều [14]. Phân đoạn ancaloit toàn phần chiết từ lá cây Khổ sâm có tác dụng kháng kí sinh trùng sốt rét Plasmodium falciparum và P.
berghei in vitro và trên chuột [19]. Tuy nhiên, các nghiên cứu sâu hơn cho thấy tác dụng này có liên quan nhiều đến các thành phần ent-kauran ditecpenoit [16, 40].
1.4.2 Tác dụng kháng vi sinh vật
Một số dịch chiết (cồn, axeton, etyl axetat và nước) và các phân đoạn ancaloit 0,5%, flavonoit 0,25% có khả năng kháng một số dòng vi khuẩn Bacillus subtilis, Escherichia coli, Klebsiella, Staphylococus aureus, nhƣng không có tác dụng đến hai chủng Samonella typhy và Shigella [1]. Các nghiên cứu tiếp theo tập trung vào các thành phần hóa học đƣợc phân lập với các chủng vi sinh vật Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Bacillus subtilis, Staphylococus aureus, Aspergilus niger, Fusarium oxysporum, Candida albicans và Saccharomyces cerevisia. Các ent-kauran ditecpenoit tiếp tục là trọng tâm của các nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm với hoạt tính mạnh kháng một phổ rộng các vi sinh vật của ent-7β-hydroxy-15-oxokaur-16-en-18-yl acetat (1) [15]. Tuy nhiên đến năm 2006 ảnh hưởng cấu trúc-hoạt tính sinh học (SAR) của các ent-kauran ditecpenoit mới đƣợc đánh giá trong nghiên cứu hoạt tính kháng vi khuẩn Staphylococus aureus đặc biệt là chủng kháng kháng sinh methicillin (MRSA). Các chất 1, 4, và 13 cho tác dụng mạnh nhất trên S. aureus và MRSA. Tất cả các hoạt chất ent-kauran ditecpenoit đều có cấu trúc xeton α,β không no trong khung ent-kauran và các nhóm thế ở C-11 và C-18 điều chỉnh các hoạt tính này [47].
1.4.3 Tác dụng chống viêm
Tác dụng ức chế yếu tố phiên mã NF-κB (nuclear factor kappa B) kiểm soát quá trình biểu hiện gen mã hóa của các cytokin, chemokin của các ent-kauran ditecpenoit từ cây Khổ sâm Bắc Bộ đã đƣợc chứng minh. Khi một chất có tác dụng ức chế NF-κB thì nó có thể thể hiện tác dụng chống viêm và cơ chế tác dụng này cũng có liên quan đến các tác dụng chống ung thư. Năm 2003, trong một chương trình nghiên cứu sàng lọc các chất có hoạt tính chống viêm từ các cây thuốc Việt Nam, các ent-kauran ditecpenoit 1-4 đã đƣợc phát hiện có tác dụng chống viêm qua tác dụng ức chế NF-κB và sự tổng hợp nitơ oxit (NO) trên tế bào RAW 264.7 gây bởi lipopolysaccharide (LPS) [41, 44]. Kết quả này đặt cơ sở cho các nghiên cứu in vivo về tác dụng chống viêm của các chất ent-kauran ditecpenoit từ cây Khổ sâm Bắc Bộ [41, 42].
Kuo P. C. và cộng sự cùng khẳng định tác dụng chống viêm của năm ent- kauran 1, 2, 3, 9 và 19 qua hoạt tính ức chế mạnh sự tổng hợp NO trên tế bào BV2 gây bởi LPS [25]. Các chất này còn ức chế sự hoạt động của enzym NADPH oxidase (NOX), một tác nhân quan trọng trong quá trình gây viêm. Hai grayanan ditecpenoit 30 và 31 cũng thể hiện tác dụng chống viêm qua thử nghiệm ức chế sự hoạt hóa enzym cyclooxygenase 2 (COX-2) gây bởi lipopolysaccharide (LPS) trên tế bào RAW 264.7. Tuy nhiên, cả hai chất này đều thể hiện tác dụng ức chế COX-2 yếu hơn so với ent-kauran 1 [20, 51].
1.4.4 Tác dụng ức chế sự phát triển của tế bào ung thƣ
Các nghiên cứu cho thấy các ent-kauran ditecpenoit thể hiện các hoạt tính chống ung thư. Thử nghiệm độc tính theo phương pháp Brine Shrimp Lethality assay đã phát hiện các hợp chất ent-kauran ditecpenoit có cấu trúc exometylen liên hợp với nhóm cacbonyl ở vòng D có các hoạt tính gây độc tế bào. Các hợp chất 3, 5 và 7 thể hiện độc tính cao, 6, 13, 14 và 16 có độc tính yếu, 8 và 15 không có độc tính [49].
Do đó, 12 hợp chất ent-kauran có cấu trúc thích hợp (thiên nhiên và tổng hợp) đã được lựa chọn cho nghiên cứu ảnh hưởng cấu trúc lên hoạt tính gây độc tế bào [2]. Đối với các dòng tế bào ung thư người, dòng tế bào ung thư phổi (LU), ung thƣ cơ vân (RD) và ung thƣ gan (Hep-G2) trong thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào theo phương pháp của NCI (Viện Ung thư Quốc gia Hoa Kỳ), các chất 1, 3, 4, 5, 6, 13 và 17 thể hiện độc tính mong muốn với cả 3 dòng tế bào ung thƣ. Các hợp chất không có cấu trúc α-methylencyclopentanon ở vòng D đều cho kết quả âm tính với 3 dòng tế bào ung thư. Ảnh hưởng làm tăng độc tính của nhóm 7α-OH và của nhóm 11β-OH đã đƣợc chứng tỏ qua nghiên cứu này. Khi nhóm 14β-OH đƣợc đƣa vào khung ent-kauran độc tính giảm đối với dòng tế bào LU và RD tuy nhiên lại tăng chọn lọc đối với Hep-G2. Sự axetyl hóa nhóm 7α-OH hoặc 14β-OH đều làm giảm nhẹ độc tính và ảnh hưởng của nhóm acetoxy ở các vị trí C-1 và C-18 thì chưa được chứng tỏ là quan trọng với dãy hợp chất ent-kauran này [2].
Dịch chiết MeOH hay phân đoạn CH2Cl2 từ Khổ sâm cho tác dụng ức chế sự phát triển của các dòng tế bào ung thƣ vú MCF-7, ung thƣ phổi NCI-H460 và SF- 268. Thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào của 11 ent-kauran đƣợc phân lập, 1-4, 8, 9, 11 và 19-22 với 4 dòng tế bào ung thƣ phổi A549, ung thƣ vú MCF-7, KB và KB-VIN (tế bào KB kháng vinblastin) cho thấy chỉ có 2 ditecpen không có độc tính là 8 và 22. Trong số các ent-kauran có độc tính, chất 1, 2, 3 và 9 cho tác dụng mạnh nhất và vai trò quan trọng cấu trúc ent-kaur-16-en-15-on, nhóm OH ở vị trí số 7 và nhóm acetyl ở vị trí số 18 đối với tác dụng ức chế sự phát triển của tế bào ung thƣ tiếp tục đƣợc khẳng định [23]. Các grayanan ditecpenoit 30 và 31 cho tác dụng ức chế yếu, trong khi các đitecpen đimeric 32 và 33 có tác dụng mạnh với tế bào ung thƣ vú (MCF-7), tế bào ung thƣ kháng adriamycin (MCF-7/ADR) và yếu với tế bào ung thƣ vú kháng tamoxifen (MCF-7/Tam) [20].
Một số ancaloit, flavonoit và tritecpenoit đƣợc phân lập từ cây Khổ sâm Bắc Bộ cũng đƣợc đánh giá hoạt tính gây độc tế bào trên dòng tế bào ung thƣ biểu mô (KB), ung thƣ màng tử cung (FI) và tiền ung thƣ thận khỉ (VR) [12].
Một thử nghiệm khác liên quan đến hoạt tính chống ung thƣ là nghiên cứu tác dụng ức chế Sirt1 (sir2α), một thành viên của Sirtuin đƣợc tìm thấy trong tế bào người. Sirtuin (còn gọi là Sir2 protein) là một nhóm protein chứa các enzym histone deacetylase hoặc monoribosyltransferase đƣợc tìm thấy ở các sinh vật, từ đơn bào đến đa bào, gồm vi khuẩn, nấm, sinh vật đa bào và cả ở người. Sirtuin đóng vai trò quan trọng trong việc điều chỉnh các quá trình sinh học trong sinh vật, có ảnh hưởng đến các quá trình sao chép, lão hóa, apoptosis. Khi nghiên cứu tác dụng ức chế lên sự hoạt động của Sirt1 của một số ditecpenoit đƣợc phân lập từ cây Khổ sâm Bắc Bộ, các chất 1-6, 15 và 23 có tác dụng ức chế Sirt1 mạnh. Cấu trúc ent- kaur-16-en-15-on tiếp tục đƣợc chứng tỏ là một yếu tố quan trọng trong hoạt tính của các ent-kauran ditecpenoit và các nhóm thế ở C-7 và C-11 có thể điều chỉnh hoạt tính ức chế Sirt 1. Các ditecpenoit dãy kauran và grayanan đều cho tác dụng ức chế kém [25]. Tác dụng ức chế Sirt1 cho thấy sự đa dạng về cơ chế tác dụng chống ung thƣ của các ent-kauran ditecpenoit đƣợc phân lập từ cây Khổ sâm Bắc Bộ.
Chương 2: NHIỆM VỤ VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU