Các phƣơng pháp phổ hiện nay là các phƣơng pháp hiện đại và hữu hiệu nhất để xác định cấu trúc của các hợp chất hữu cơ. Các phƣơng pháp đƣợc sử dụng để xác định cấu trúc các hợp chất trong Luận văn này bao gồm:
- Phổ khối lƣợng va chạm điện tử (EI-MS); - Phổ khối lƣợng phun bụi điện tử (ESI-MS); - Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân proton (1H-NMR);
- Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân cacbon 13 (13C-NMR) với chƣơng trình DEPT;
Chƣơng 3: THỰC NGHIỆM 3.1 THIẾT BỊ VÀ HÓA CHẤT
Sắc ký lớp mỏng (TLC) đƣợc thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn silica gel Merck (Darmstadt, CHLB Đức) DC-Alufolien 60 F254 có chiều dày 0,2 mm trên nền nhôm.
Sắc ký cột thƣờng (CC), sắc ký cô ̣t nhanh (FC) và sắc ký cột tinh chế (Mini- C) đƣợc thực hiện trên silica gel Merck (Darmstadt, CHLB Đƣ́c) cỡ ha ̣t 63-200 μm, 63-100 μm và 40-63 μm.
Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) Agilent 1100 series HPLC- DAD (Agilent Technology, Hoa Kỳ) bao gồm bơm G1311A, đetectơ G1315A Diode Array Detector (DAD), manual sampler 7725i và loop mẫu 20 l. Phân tích đƣợc thực hiện trên cột sắc ký Lichrospher RP-18 (cỡ hạt 5 m, 4,0 mm 250 mm) và cột bảo vệ C18 (cỡ hạt 5 m, 4,6 mm 7,5 mm) (Agilent Technology). Kiểm soát hệ thống sắc ký và xử lý số liệu đƣợc thực hiện với phần mềm Hewlett Packard ChemStation.
Phổ khối lƣợng va chạm điện tử (EI-MS) đƣợc ghi trên thiết bị HP-5989B mass spectrometer.
Phổ khối lƣợng phun bụi điện tử (ESI-MS) đƣợc ghi trên thiết bị Agilent 6310 Ion Trap.
Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân proton (1H-NMR, 500 MHz), phổ cộng hƣởng từ hạt nhân cacbon 13 (13C-NMR, 125 MHz) với chƣơng trình DEPT và phổ cộng hƣởng từ hạt nhân hai chiều (2D NMR) đƣợc ghi trên thiết bị Bruker AV 500 spectrometer. Độ chuyển dịch hóa học (δ) đƣợc biểu thị theo ppm. Tetrametylsilan (TMS) là chất chuẩn nội zero.
Nguyên liệu thực vật là cành nhỏ cây Khổ sâm Bắc Bộ (Croton tonkinensis
Gagnep., Euphorbiaceae) đƣợc thu thập tại huyện Mỹ Đức (Hà Tây cũ) vào tháng 9 năm 2010.
Mẫu thực vật đƣợc lƣu tiêu bản tại phòng thí nghiệm Hóa học các Hợp chất thiên nhiên, Khoa Hóa học, Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội.
3.3 ĐIỀU CHẾ CÁC PHẦN CHIẾT TỪ CÂY KHỔ SÂM
Cành nhỏ cây Khổ sâm Bắc Bộ dài (2 kg) đƣợc cắt thành các đoạn nhỏ 5 cm (đƣờng kính 5 mm), sấy ở nhiệt độ 50 oC. Cành đƣợc ngâm chiết với metanol ở nhiệt độ phòng 3 lần, mỗi lần trong 4 ngày. Sau khi lọc tách nguyên liệu rắn các dịch lọc MeOH đƣợc gộp lại và cất loại MeOH dƣới áp suất giảm cho một phần chiết MeOH (kí hiệu là CT).
Phần chiết MeOH đƣợc hòa bằng nƣớc cất sau đó đƣợc chiết lần lƣợt với các dung môi có độ phân cực tăng dần, n-hexan, điclometan và etyl axetat cho các dịch chiết hữu cơ tƣơng ứng. Các dịch chiết này đƣợc làm khan bằng Na2SO4 sau đó đƣợc cất loại kiệt dung môi dƣới áp suất giảm thu đƣợc các phần chiết tƣơng ứng n- hexan, điclometan và etyl axetat. Cất kiệt dịch nƣớc còn lại dƣới áp suất giảm ở 100 °C cho phần chiết nƣớc.
Quy trình điều chế các phần chiết từ cành nhỏ cây Khổ sâm Bắc Bộ đƣợc trình bày tóm tắt ở Sơ đồ 1, Mục 4.2, Chƣơng 4: Kết quả và Thảo luận.
Hiệu suất thu nhận các phần chiết từ cành cây Khổ sâm Bắc Bộ đƣợc trình bày ở Bảng 1.
Bảng 1: Hiệu suất điều chế các phần chiết từ cành nhỏ cây Khổ sâm Bắc Bộ
STT Phần chiết Khối lƣợng (g) Hiệu suất (%) a)
1 n-Hexan (CTH) 25,0 1,25
2 Điclometan (CTD) 9,3 0,47
3 Etyl axetat (CTE) 1,0 0,05
4 Nƣớc (CTW) 12,6 0,63
a)Hiệu suất đƣợc tính theo khối lƣợng nguyên liệu khô
3.4 PHÂN TÍCH CÁC PHẦN CHIẾT BẰNG SẮC KÝ LỚP MỎNG
Phân tích sắc ký lớp mỏng (TLC) đƣợc thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn silica gel Merck DC-Alufolien 60 F254 có chiều dày 0,2 mm trên nền nhôm.
Thuốc thử hiện màu là dung dịch vanilin/H2SO4 đặc 1%, bản mỏng sau khi phun thuốc thử đƣợc hơ nóng ở 120 oC hoặc thuốc thử Dragendorff.
3.4.1 Phân tích phần chiết n-hexan (CTH)
Hệ dung môi triển khai cho sắc ký lớp mỏng phần chiết n-hexan là n-hexan-
axeton với tỷ lệ 19:1 và 3:1 (v/v). (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Kết quả phân tích TLC phần chiết n-hexan cành nhỏ cây Khổ sâm Bắc Bộ (CTH) đƣợc trình bày ở Bảng 2.
Bảng 2: Phân tích TLC phần chiết n-hexan (CTH) Hệ dung môi n-hexan-axeton STT Rf Dạng vệt Hiện màu (vanilin/H2SO4) 19:1 1 0,90 Tròn Tím 2 0,80 Tròn Tím hồng 3 0,57 Tròn Tím 4 0,50 Tròn Tím 5 0,27 Tròn Tím hồng 3:1 1 0,93 Tròn Tím 2 0,70 Tròn Tím 3 0,60 Tròn Tím hồng 4 0,40 Tròn Tím 5 0,27 Tròn Tím
3.4.2 Phân tích phần chiết điclometan (CTD)
Hệ dung môi triển khai cho sắc ký lớp mỏng phần chiết điclometan là n-
hexan-axeton với các tỷ lệ khác nhau 19:1, 12:1, 9:1 và 3:1 (v/v).
Kết quả phân tích TLC phần chiết điclometan cành nhỏ cây Khổ sâm Bắc Bộ (CTD) đƣợc trình bày ở Bảng 3.
Bảng 3: Phân tích phần chiết điclometan (CTD) Hệ dung môi n-hexan-axeton STT Rf Dạng vệt Hiện màu (vanilin/H2SO4) 19:1 1 0,90 Tròn Tím 2 0,80 Tròn Tím hồng 3 0,57 Tròn Tím 4 0,50 Tròn Tím 5 0,27 Tròn Tím hồng 12:1 1 0.85 Tròn Tím 2 0,76 Tròn Tím hồng 3 0,61 Tròn Tím 4 0,53 Tròn Tím 5 0,21 Tròn Tím hồng 9:1 1 0,90 Tròn Tím 2 0,80 Tròn Tím 3 0,57 Dài Tím 4 0,33 Tròn Tím hồng 3:1 1 0,93 Tròn Tím 2 0,70 Tròn Tím 3 0,60 Tròn Tím hồng 4 0,40 Tròn Tím 5 0,27 Tròn Tím
3.4.3 Phân tích phần chiết etyl axetat (CTE)
Hệ dung môi triển khai TLC phần chiết etyl axetat là điclometan-metanol với tỷ lệ 19:1 và 9:1 (v/v).
Kết quả phân tích TLC phần chiết etyl axetat cành nhỏ cây Khổ sâm (CTE) đƣợc trình bày ở Bảng 4.
Bảng 4: Phân tích phần chiết etyl axetat (CTE) Hệ dung môi CH2Cl2-MeOH STT Rf Dạng vệt Hiện màu ( vanilin/H2SO4) 19:1 1 0,97 Tròn Tím 2 0,85 Tròn Tím 3 0,58 Tròn Tím 4 0,36 Tròn Tím đậm 5 0,18 Tròn Tím đậm 9:1 1 0,95 Tròn Tím 2 0,88 Tròn Tím 3 0,58 Tròn Tím đậm 4 0,48 Tròn Tím đậm
3.5 PHÂN TÁCH CÁC PHẦN CHIẾT VÀ PHÂN LẬP CÁC HỢP CHẤTCHẤT CHẤT
3.5.1 Phân tách phần chiết n-hexan (CTH)
Phần chiết n-hexan (15 g) đƣợc phân tách bằng sắc ký cột thƣờng (CC) trên silica gel (Merck, 63-200 µm). Mẫu đƣợc đƣa lên cột theo phƣơng pháp tẩm mẫu trên silica gel. Rửa giải sắc ký với n-hexan và hệ dung môi gradient n-hexan-axeton
với các tỷ lệ 49:1, 29:1, 19:1, 12:1, 9:1, 3:1 và 2:1 (v/v) đƣợc 31 phân đoạn, mỗi phân đoạn 100 ml. Các phân đoạn có sắc ký đồ TLC giống nhau đƣợc gộp lại và cất loại dung môi dƣới áp suất giảm cho 9 nhóm phân đoạn CTH1 (các phân đoạn 1-6),
CTH2 (7-11), CTH3 (12-15), CTH4 (16-17), CTH5 (18-21), CTH6 (22-25),
CTH7 (26-28), CTH8 (29-31) và CTH9 (32-34).
Nhóm phân đoạn CTH3 (2,6 g) đƣợc rửa bằng n-hexan cho các tinh thể hình kim màu trắng CTH3 (chất I) (0,41 g).
Nhóm phân đoạn CTH5 (5,06 g) đƣợc rửa bằng n-hexan sau đó rửa với hệ dung môi n-hexan-axeton 5:1, sau đó kết tinh lại trong axeton cho các tinh thể hình kim không màu CTH5 (chất II) (27 mg).
Dịch rửa của nhóm phân đoạn CTH5 đƣợc tinh chế bằng sắc kí cột nhanh (FC) gradient trên silica gel với n-hexan và n-hexan-axeton 19:1, 12:1, 9:1, 5:1 và 3:1. Các phân đoạn cho sắc ký đồ TLC giống nhau đƣợc gộp lại thành 4 nhóm phân đoạn từ CTH5.1 đến CTH5.4. Nhóm phân đoạn CTH5.2 (0,43 g)đƣợc rửa bằng n-
hexan-axeton, sau đó đƣợc kết tinh lại trong axeton cho tinh thể hình kim không màu CTH5.2. Phân tích TLC và co-TLC cho thấy chất CTH5.2 là chất II (33 mg).
Nhóm phân đoạn CTH6 (2,02 g) đƣợc tinh chế bằng Mini-C trên silica gel (40-63 µm) với hệ dung môi gradient n-hexan-axeton 4:1, 3:1 và 1:1. Qua phân tích TLC các phân đoạn đƣợc gộp thành 5 nhóm phân đoạn từ CTH6.1 đến CTH6.5. Nhóm phân đoạn CTH6.4 đƣợc rửa với hệ dung môi n-hexan-axeton, sau đó kết tinh lại trong hệ dung môi điclometan-axeton cho tinh thể hình kim màu trắng
CTH6.4 (chất III) (15 mg).
Nhóm phân đoạn CTH9 đƣợc rửa bằng MeOH cho chất bột màu trắng, khó tan trong các loại dung môi CTH9 (chất IV) (73,4 mg).
Quá trình phân tách phần chiết n-hexan đƣợc trình bày trong Sơ đồ 2, Mục 4.3, Chƣơng 4: Kết quả và Thảo luận.
3.5.2 Phân tách phần chiết điclometan (CTD)
Phần chiết điclometan (CTD) (9 g) đƣợc phân tách bằng sắc ký cột (CC) trên silica gel (Merck, 0,063-0,2 mm), kích thƣớc cột 2 x 30 cm. Mẫu đƣợc đƣa lên cột theo phƣơng pháp tẩm mẫu trên silica gel. Rửa giải sắc ký với n-hexan và hệ dung môi gradient n-hexan-axeton 27:1, 19:1, 12:1, 9:1, 6:1 và 3:1 (v/v) cho 67 phân đoạn, mỗi phân đoạn 20 ml. Các phân đoạn có TLC giống nhau đƣợc gộp lại và cất loại dung môi dƣới áp suất giảm cho 6 nhóm phân đoạn CTD1 (các phân đoạn 2-6),
CTD2 (7-15), CTD3 (16-26), CTD4 (27-41), CTD5 (42-58) và CTD6 (59-67). Nhóm phân đoạn CTD1 (0,9 g) đƣợc rửa bằng n-hexan để loại bớt dầu, sau đó đƣợc tinh chế nhiều lần bằng Mini-C trên silica gel cỡ hạt 40-63 µm, rửa giải với
n-hexan và hệ dung môi n-hexan-axeton 49:1, 19:1, 9:1, 6:1 và 3:1 cho các chất
CTD1.1 (chất V) (7,5 mg) và CTD1.2 (chất VI) (5 mg) dƣới dạng tinh thể màu trắng. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Nhóm phân đoạn CTD2 (0,86 g) đƣợc rửa bằng n-hexan cho các tinh thể hình kim màu trắng CTD2 (0,47 g). Phân tích TLC và co-TLC cho thấy chất này là chất I đƣợc phân lập từ CTH3.
Nhóm phân đoạn CTD4 (0,65 g) đƣợc rửa bằng n-hexan và hệ dung môi n-
hexan-axeton sau đó đƣợc kết tinh lại trong axeton cho các tinh thể hình kim không màu CTD4 (0,21 g). Phân tích TLC cho thấy các tinh thể này là chất II đã đƣợc phân lập từ nhóm phân đoạn CTH5.
Nhóm phân đoạn CTD5 (1,5 g) đƣợc tinh chế trên silica gel cỡ hạt 40-63 µm, rửa giải với hệ dung môi gradient n-hexan-axeton. Dựa trên phân tích TLC các phân đoạn có sắc kí đồ giống nhau đƣợc gộp lại cho 5 nhóm phân đoạn từ CTD5.1
đến CTD5.5. Nhóm phân đoạn CTD5.2 (0,18 g) đƣợc rửa với hệ dung môi n-
hexan-axeton cho các tinh thể hình kim màu trắng CTD5.2.1 (chất VII) (2 mg). Phần dịch rửa tiếp tục đƣợc tinh chế tiếp bằng Mini-C trên silica gel cỡ hạt 15-40 µm, với hệ dung môi gradient điclometan-axeton 19:1, 12:1, 9:1, 6:1 và 4:1 cho 2
chất là CTD5.2.1 (VII) (2,8 mg) và CTD5.2.2 (5 mg). So sánh TLC và co-TLC cho thấy CTD5.2.2 là chất III đƣợc phân lập từ CTH6.
Nhóm phân đoạn CTD6 (4,06 g) đƣợc rửa bằng MeOH, sau đó đƣợc tinh chế Mini-C trên silica gel 40-63 µm, hệ dung môi gradient n-hexan-axeton 3:1, 2:1 và 1:1 cho chất bột màu trắng là CTD6 (54 mg). So sánh TLC cho thấy CTD6 là chất
IV nhận đƣợc ở phân đoạn CTH9.
Quá trình phân tách phần chiết điclometan đƣợc trình bày trong Sơ đồ 2, Mục 4.3, Chƣơng 4: Kết quả và Thảo luận.
3.5.3 Phân tách phần chiết etyl axetat (CTE)
Phần chiết etyl axetat (CTE) (1 g) đƣợc phân tách bằng sắc ký cột CC trên silica gel (Merck, 63-200 μm). Mẫu đƣợc đƣa lên cột theo phƣơng pháp tẩm mẫu trên silica gel. Rửa giải với CH2Cl2 và hệ dung môi gradient CH2Cl2-MeOH 29:1, 19:1, 9:1, 3:1, 2:1 và 1:1 (v/v) cho 35 phân đoạn, mỗi phân đoạn 20 ml. Các phân đoạn có TLC giống nhau đƣợc gộp lại và đƣợc cất loại dung môi dƣới áp suất giảm cho 4 nhóm phân đoạn CTE1 (các phân đoạn 1-9), CTE2 (10-15), CTE3 (16-28) và CTE4 (29-35).
Nhóm phân đoạn CTE2 (0,17 g) đƣợc rửa bằng MeOH cho chất bột vô định hình màu trắng là CTE2 (8 mg). So sánh TLC cho thấy CTE2 là chất IV nhận đƣợc ở phân đoạn CTH9 và CTD6.
Quá trình phân tách phần chiết etyl axetat đƣợc trình bày trong Sơ đồ 2, Mục 4.3, Chƣơng 4: Kết quả và Thảo luận.
3.5.4 Phân tách phần chiết nƣớc (CTW1)
Phần chiết nƣớc (CTW) đƣợc phân tách gradient bằng cột CC trên nhựa polyme Dianion HP-20 với H2O, 20%, 40%, 60% MeOH-H2O và MeOH cho các phân đoạn tƣơng ứng kí hiệu CTW1, CTW2 và CTW3.
Kết quả phân tích TLC phần chiết CTW1 cành nhỏ cây Khổ sâm đƣợc trình bày ở Bảng 5.
Bảng 5: Phân tích TLC phần chiết nƣớc (CTW1)
Hệ dung môi EtOAc-H2O-HCOOH STT Rf Dạng vệt Hiện màu (vanilin/H2SO4) 17:3:2 1 0,78 Tròn Tím 2 0,39 Tròn Tím 3 0,26 Tròn Tím đen 4 0,12 Tròn Tím hồng 10:3:2 1 0,88 Tròn Tím 2 0,56 Dài Tím 3 0,41 Tròn Tím hồng
Phân đoạn 20% MeOH-H2O (CTW1) (2,5 g) đƣợc phân tách bằng sắc ký cột (CC), kích thƣớc 2 x 25 cm trên silica gel (Merck, cỡ hạt 63-200 μm). Mẫu đƣợc đƣa lên cột theo phƣơng pháp tẩm mẫu trên silica gel. Rửa giải bằng CH2Cl2 và hệ dung môi gradient điclometan-metanol với các tỷ lệ 19:1, 12:1, 9:1, 6:1 và 4:1 (v/v) cho 48 phân đoạn, mỗi phân đoạn 20 ml. Các phân đoạn có TLC giống nhau đƣợc gộp lại và cất loại dung môi dƣới áp suất giảm cho 6 nhóm phân đoạn CTW1.1 (các phân đoạn 1-8), CTW1.2 (9-10), CTW1.3 (11-14), CTW1.4 (25-27), CTW1.5 (28- 40) và CTW1.6 (41-48).
Nhóm phân đoạn CTW1.4 đƣợc rửa với MeOH, cho tinh thể hình kim màu trắng là CTW1.4 (18 mg) (chất VIII).
Quá trình phân tách phần chiết nƣớc (CTW1) đƣợc trình bày trong Sơ đồ 2, Mục 4.3, Chƣơng 4: Kết quả và Thảo luận.
3.6 HẰNG SỐ VẬT LÝ VÀ DỮ KIỆN PHỔ CỦA CÁC HỢP CHẤT ĐƢỢC PHÂN LẬP ĐƢỢC PHÂN LẬP ĐƢỢC PHÂN LẬP
β-Sitosterol (I)
Đƣợc phân lập từ phân đoạn CTH3 và CTD2. Tinh thể hình kim màu trắng, đ.n.c. 135-136 oC.
Rf = 0,44 (TLC, silica gel, n-hexan-EtOAc 4:1, v/v), hiện màu tím với thuốc thử vanilin/H2SO4 đặc 1%.
Hợp chất này đƣợc nhận dạng trên cơ sở so sánh TLC và co-TLC với chất chuẩn β-sitosterol.
ent-7β-Hydroxy-15-oxokaur-16-en-18-yl acetat (II)
Đƣợc phân lập từ phân đoạn CTH.5 và CTD.4. Tinh thể hình kim không màu, đ.n.c. 132-135 oC.
Rf = 0,5 (TLC, silica gel, n-hexan-axeton 3:1, v/v), hiện màu tím với thuốc thử vanilin/H2SO4 đặc 1% và hiện màu da cam với thuốc thử Dragendorff. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Hợp chất này đƣợc nhận dạng dựa trên cơ sở so sánh TLC, co-TLC và phân tích HPLC với chất chuẩn ent-7β-hydroxy-15-oxokaur-16-en-18-yl acetat.
Asperglaucid (III)
Đƣợc phân lập từ phân đoạn CTH6 và CT5.2.2. Tinh thể hình kim màu trắng, đ.n.c. 185-187 oC.
Rf = 0,79 (TLC, silica gel, điclometan-axeton 9:1, v/v) hiện màu xanh đen với thuốc thử Dragendorff và không hiện màu với thuốc thử vanilin/H2SO4 đặc 1%.
EI-MS: m/z (%) 444 (M+., C27H28O4N2, 1,5), 384 (1,1), 368 (0,5), 353 (3,9), 323 (3,4), 311 (6,2), 293 (2,0), 269 (12,8), 253 (11,5), 252 (66,4), 232 (7,8), 225
(51,1), 194 (1,7), 190 (2,0), 176 (4,2), 172 (11,7), 131 (8,5), 105 (100), 91 (9,7), 77 (18,4), 60 (2,0). 1H-NMR (CDCl3): δ (ppm), 2,02 (3H, s, CH3COO-), 2,75 (2H, m, 2H-3), 3,06 (1H, dd, J = 13,5 Hz, 8,5 Hz, H-3'a), 3,21 (1H, dd, J = 13,5 Hz, 6,0 Hz, H- 3'b), 3,81 (1H, dd, J = 11,0 Hz, 4,5 Hz, H-1a), 3,92 (1H, dd, J = 11,0 Hz, 5,0 Hz, H-1b), 4,35 (1H, m, H-2), 4,76 (1H, m, H-2'), 5,94 (1H, d, J = 8,5 Hz, NH-1"a), 6,72 (1H, d, J = 7,5 Hz, NH-1'a), 7,07 (2H, d, J = 8,3 Hz, H-5, H-9), 7,15 (3H, m, H-6, H-7, H-8), 7,26 (3H, m, H-6', H-7', H-8'), 7,26 (2H, m, H-5', H-9'), 7,43 (2H, t, J = 8,5 Hz, H-4", H-6"), 7,52 (1H, t, J = 8,5 Hz, H-5"), 7,70 (2H, d, J = 8,5 Hz, H-3", H-7"). 13C-NMR (CDCl3): δ (ppm) 37,5 (t, C-3), 38,4 (t, C-3'), 49,5 (d, C-2), 55,0 (d, C-2'), 64,6 (t, C-1), 126,8 (d, C-7), 127,1 (2d, C-3", C-7"), 127,2 (d, C-7'), 128,6 (2d, C-6', C-8'), 128,7 (2d, C-6, C-8), 128,8 (2d, C-4", C-6"), 129,1 (2d, C- 5', C-9'), 129,3 (2d, C-5, C-9), 133,7 (s, C-2"), 131,9 (d, C-5"), 136,6 (s, C-4'), 136,7 (s, C-4), 167,1 (s, C-1"), 170,3 (s, C-1'), 170,7 (s)/20,8 (q) (1-OAc).
β-Sitosterol-3-O-β-D-glucopyranosid (IV)
Đƣợc phân lập từ phân đoạn CTH9, CTD6 và CTE2. Bột vô định hình màu trắng, đ.n.c. 281-283 oC.
Rf = 0,41 (TLC, silica gel, n-hexan-axeton 1:1, v/v), Rf = 0,53 (TLC, silica gel, điclometan-metanol 6:1, v/v) và hiện màu tím với thuốc thử vanilin/H2SO4 đặc 1%. 1H-NMR (DMSO-d6): δ (ppm) 0,66 (3H, s, 19-CH3), 0,80 (3H, t, J = 6,5 Hz, 29-CH3), 0,82 (3H, d, J = 7,0 Hz, 27-CH3), 0,83 (3H, d, J = 7,0 Hz, 26-CH3), 0,9 (3H, d, J = 6,5 Hz, 21-CH3), 0,96 (3H, s, 18-CH3), 2,91 (1H, m), 3,06 (2H, m), 3,14 (1H, m), 3,44 (1H, m) (H-2', H-3', H-4', H-5', H-6'a), 3,44 (1H, m, H-3), 3,65 (1H, dd, J = 11,0 Hz, 3,5 Hz, H-6'b), 4,23 (1H, d, J = 7,5 Hz, H-1'), 5,32 (1H, br s, H-6).
13C-NMR (DMSO-d6): δ (ppm) 11,5 (q, C-29), 11,6 (q, C-18), 18,5 (q, C- 26), 18,8 (q, C-21), 18,9 (q, C-19), 19,5 (q, C-27), 20,5 (t, C-11), 22,5 (t, C-28), 23,7 (t, C-15), 27,6 (t, C-23), 28,7 (d, C-25), 29,2 (t, C-2, C-16), 31,2 (t, C-7), 31,3 (d, C-8), 33,3 (t, C-22), 35,3 (d, C-20), 36,1 (t, C-10), 36,7 (t, C-1), 38,2 (t, C-12), 41,7 (s, C-4), 45,1 (d, C-24), 49,5 (d, C-9), 55,4 (d, C-17), 56,1 (d, C-14), 61,0 (t, C-6'), 70,1 (d, C-4'), 73,4 (t, C-2'), 76,6 (t, C-3'), 76,7 (d, C-3), 76,9 (d, C-5'), 100,7 (d, C-1'), 121,0 (d, C-6), 140,4 (s, C-5).
Acid acetyl aleuritolic (V)
Đƣợc phân lập từ phân đoạn CTD1.1.
Tinh thể hình kim màu trắng, đ.n.c. 273-275 oC.
Rf = 0,49 (TLC, silica gel, n-hexan-axeton 6:1, v/v), hiện màu tím với thuốc thử vanilin/H2SO4 đặc 1%. 1H-NMR (CDCl3): δ (ppm) 0,85 (3H, s, 24-CH3), 0,88 (3H, s, 23-CH3), 0,91 (3H, s, 30-CH3), 0,92 (3H, s, 27-CH3), 0,94 (3H, s, 29-CH3), 0,95 (3H, s, 25-CH3), 0,96 (3H, s, 26-CH3), 2,04 (3H, s, 3-OAc), 2,28 (1H, dd, J = 14,5 Hz, 2,0 Hz, H- 18), 2,37 (1H, dd, J = 14,5 Hz, 7,5 Hz, H-12), 4,46 (1H, dd, J = 11,0 Hz, 5,0 Hz, H-3), 5,52 (1H, dd, J = 8,0 Hz, 3,0 Hz, H-15). 13C-NMR (CDCl3): δ (ppm) 15,6 (q, C-25), 16,6 (q, C-24), 17,3 (t, C-11), 18,7 (t, C-6), 21,3 (q, 1-OAc), 22,4 (q, C-27), 23,5 (t, C-2), 26,2 (q, C-26), 27,9 (q, C-23), 28,7 (q, C-30), 29,3 (s, C-20), 30,8 (t, C-22), 31,4 (t, C-16), 31,9 (q, C-29), 33,4 (t, C-12), 33,7 (t, C-21), 35,4 (t, C-19), 37,3 (s, C-13), 37,4 (t, C-1), 37,7 (s, C-4), 37,9 (s, C-10), 39,1 (s, C-8), 40,8 (t, C-7), 41,5 (d, C-18), 49,1 (d, C-9), 51,4 (s, C-17), 55,7 (d, C-5), 80,9 (d, C-3), 116,8 (d, C-15), 160,6 (s, C-14), 170,9 (s, 1- OAc), 184,0 (s, 28-COOH). Acid stearic
Rf = 0,49 (TLC, silica gel, n-hexan-axeton 6:1, v/v), khó hiện màu tím với thuốc thử vanilin/H2SO4 đặc 1%.
1H-NMR (CDCl3): δ (ppm) 0,88 (3H, t, J = 7,0 Hz, 3H-17), 1,26 (28H, s br, 2H-4 –> 2H-16), 1,63 (2H, quintet, J = 7,5 Hz, 2H-3), 2,34 (2H, t, J = 7,5 Hz, 2H- 2).
Ent-1α-Acetoxy-7β,14α-dihydroxykaur-16-en-15-on (VII)
Đƣợc phân lập từ phân đoạn CTD5.2.1. Tinh thể hình kim màu trắng, đ.n.c. 96-98 oC.
Rf = 0,66 (TLC, silica gel, điclometan-axeton 9:1, v/v), hiện màu nâu với thuốc thử vanilin/H2SO4 đặc 1%, hiện màu da cam với thuốc thử Dragendorff.
ESI-MS: 375,61 ([M–H]¯, C22H31O5). 1 H-NMR (CDCl3): δ (ppm) 0,90 (3H, s, 18-CH3), 0,98 (3H, s, 19-CH3), 1,15 (3H, s, 20-CH3), 1,99 (3H, s, 1-OAc), 4,38 (1H, dd, J = 12,5 Hz, 4,0 Hz, H-7), 4,85 (1H, br s, H-1), 4,89 (1H, s, H-14), 5,42 (1H, s, H-17a), 6,18 (1H, s, H-17b). 13C-NMR (CDCl3): δ (ppm) 16,8 (t, C-11), 18,6 (q, C-20), 21,5 (q, C-19), 22,7 (t, C-2), 27,7 (t, C-6), 30,9 (t, C-12), 32,9 (s, C-4), 33,3 (q, C-18), 34,9 (t, C- 3), 42,8 (s, C-10), 45,9 (d, C-13), 46,3 (d, C-5), 47,3 (d, C-9), 61,4 (s, C-8), 72,8 (d, C-1), 74,5 (d, C-7), 74,9 (d, C-14), 118,2 (t, C-17), 147,4 (s, C-16), 170,1 (t)/21,2 (q), (1-OAc), 207,9 (s, C-15).