2.2.1. Dụng cụ, hĩa chất
Các dung mơi để ngâm chiết mẫu đều dùng loại tinh khiết (pure), khi dùng cho các loại sắc ký cột, sắc ký lớp mỏng, sắc ký lớp mỏng điều chế sử dụng loại tinh khiết phân tích (p.a).
Sắc ký lớp mỏng tự chế với các kích thước khác nhau đã dùng loại silicagel G60 của hãng Merck tráng trên tấm thuỷ tinh và hoạt hĩa ở nhiệt độ 120 0C thời gian từ 6 giờ đến 8 giờ. Sắc ký lớp mỏng đế nhơm tráng sẵn Kieselgel 60F254 độ dày 0,2 mm (Art. 5554).
Các hệ dung mơi triển khai SKLM:
STT Hệ dung mơi (Tỉ lệ thể tích) Kí hiệu
1 n-Hexan - EtOAc (4 : 1) hệ A
2 n-Hexan - EtOAc (2 : 1) hệ B
3 Clorofom - metanol (9 : 1) hệ C 4 Clorofom - metanol (2 : 1) hệ D
Các sắc ký lớp mỏng (SKLM) được soi dưới đèn tử ngoại ở 254 nm (cho loại kieselgel 60F254), sau đĩ phun thuốc thử vanilin - H2SO4 5% và sấy ở trên 100 oC, để phát hiện các hợp chất.
Các giá trị Rf trong hệ dung mơi triển khai biểu thị là Rf A (B, C, D)x100. Sắc ký cột thường sử dụng silica gel Merck 60, cỡ hạt 70-230 mesh (0,040 - 0,063 mm) và 230-400 mesh (0,063 - 0,200 mm).
2.2.2. Thiết bị nghiên cứu
Nhiệt độ nĩng chảy đo trên kính hiển vi Boёtus (Đức) hoặc trên máy Electrothermal IA-9200.
Phổ IR được ghi trên máy IMPACT 410 sử dụng đĩa nén tinh thể KBr. Phổ MS đo trên máy Varian-FT-ICR/HRMS của Viện hĩa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Cơng nghệ Việt Nam.
Phổ cộng hưởng từ nhân (NMR) được đo trên máy Bruker AM500 FT- NMR Spectrometer, Viện Hĩa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Cơng nghệ Việt Nam.
2.3. Thu nhận các dịch chiết từ cây Ngũ vị vảy chồi 2.3.1. Thu nhận các dịch chiết 2.3.1. Thu nhận các dịch chiết
Mẫu thân cây tươi mới thu hái được sấy khơ đem nghiền nhỏ rồi ngâm kiệt với metanol ở nhiệt độ phịng cho đến khi nhạt màu. Dịch chiết được cất loại dung mơi bằng máy cất quay ở nhiệt độ thấp và áp suất giảm. Cặn dịch chiết metanol được chiết lần lượt với n-hexan, diclometan, etylaxetat, metanol và thu được các cặn chiết tương ứng, sau khi đuổi hết dung mơi cho các cặn tương ứng là SPH (cặn n-hexan), SPD (cặn diclometan), SPE (cặn EtOAc) và
SPM (cặn metanol). Việc thu nhận các dịch chiết từ cây Ngũ vị vảy chồi (Schisandra perulata) theo sơ đồ sau:
Các phân đoạn dịch chiết nĩi trên được làm khan bằng Na2SO4, lọc qua giấy lọc rồi cất kiệt dung mơi dưới áp suất giảm, cặn được sấy khơ và cân đến khối lượng khơng đổi. Như vậy, từ cây Schisandra perulata thu
được 4 loại cặn chiết được ký hiệu lần lượt là: SPH, SPD, SPE và SPM.
Ở đĩ: SPH: Cặn chiết n-Hexan của cây Schisandra perulata
SPD: Cặn chiết CH2Cl2 của cây Schisandra perulata
SPE: Cặn chiết EtOAc của cây Schisandra perulata
SPM: Cặn chiết MeOH của cây Schisandra perulata
Kết quả thu nhận các dịch chiết từ cây Ngũ vị vảy chồi ở Sapa, Lào Cai được nêu trong bảng 2.1.
Bảng 2.1. Khối lượng các cặn chiết thu được từ cây
Schisandra perulata
Khối lượng cặn chiết thu được (g) từ 312,1 g cặn MeOH đem chiết Mẫu thu vào tháng 08/2012 Khối lượng mẫu khơ (g) Khối lượng cặn metanol tổng
(g) n-hexan CH2Cl2 EtOAc MeOH
Thân 2500 312,1 51,1 ( SPH) 19,0 (SPD) 49,2 ( SPE) 163 (SPM) 2.3.2. Khảo sát định tính các dịch chiết 2.3.2.1. Phát hiện các hợp chất sterol
Lấy 0,01g cặn của các phân đoạn, thêm 2 ml dung dịch NaOH 10% đun cách thủy đến khơ. Hồ tan cặn trong 3 ml clorofom - lấy dịch clorofom để làm phản ứng định tính các sterol và thuốc thử Lieberman - Bourchardt (gồm hỗn hợp 1 ml anhydrit axetic + 1 ml cloroform để lạnh ở 0 0C, sau đĩ cho
thêm 1 giọt H2SO4 đậm đặc). Lấy 1 ml dịch clorofom rồi thêm 1 giọt thuốc thử, dung dịch xuất hiện màu xanh trong 1 thời gian là phản ứng dương tính.
2.3.2.2. Phát hiện các ancaloit
Lấy 0.01g cặn các phân đoạn, thêm 5ml HCl, khuấy đều, lọc qua giấy lọc, lấy vào 3 ống nghiệm, mỗi ống 1ml nước lọc axit.
Ống (1): 1 - 2 giọt dung dịch silicostungtic axit 5%, nếu cĩ tủa trắng và nhiều là phản ứng dương tính.
Ống (2): 1 - 2 giọt thuốc thử Dragendorff , nếu xuất hiện màu da cam là phản ứng dương tính.
Ống (3): 3 - 5 giọt thuốc thử Mayer, nếu xuất hiện tủa trắng là phản ứng dương tính.
2.3.2.3. Phát hiện các flavonoit
Lấy 0,01g cặn của các phân đoạn, thêm 10ml metanol, đun nĩng cho tan và lọc qua giấy lọc. Lấy 2ml nước lọc vào ống nghiệm, thêm một ít bột magiê (Mg) hoặc Zn, sau đĩ cho vào 5 giọt HCl đậm đặc, đun trong bình cách thuỷ vài phút. Dung dịch xuất hiện màu đỏ, hoặc màu hồng là phản ứng dương tính với các flavonoit.
2.3.2.4. Phát hiện các cumarin
Dịch để thử định tính được chuẩn bị như mục 2.3.2.1. Lấy vào 2 ống
nghiệm, mỗi ống 2 ml dịch thử cho vào một trong 2 ống đĩ 0,5 ml dung dịch NaOH 10%. Đun cách thuỷ cả hai ống trên đến sơi, để nguội rồi cho thêm 4 ml nước cất vào mỗi ống. Nếu chất lỏng ở ống cĩ kiềm trong hơn ở ống khơng kiềm cĩ thể xem là phản ứng dương tính, nếu đem axit hố ống cĩ kiềm bằng một vài giọt HCl đậm đặc sẽ làm cho dịch đang trong vẩn đục và màu vàng xuất hiện cĩ thể tạo ra tủa là phản ứng dương tính.
Ngồi ra, cĩ thể làm phản ứng diazo hố với axit sulfanilic trong mơi trường axit, nếu cho màu da cam đến cam nhạt, cho kết quả dương tính đối với cumarin.
2.3.2.5. Định tính các glucosit tim
Chuẩn bị dịch thử định tính cũng làm như mục 2.3.2.1.
Phản ứng Legal: cho vào ống nghiệm 0,5ml dịch thử, thêm vào 1 giọt
dung dịch natri prussiat 0,5% và 2 giọt NaOH 10% nếu xuất hiện màu đỏ là phản ứng dương tính với vịng butenolit.
Phản ứng Keller - Kilian: Thuốc thử gồm 2 dung dịch. Dung dịch 1: 100ml axit axetic lỗng + 1ml FeCl3 5% Dung dịch 2: 100ml axit H2SO4 đậm đặc + 1ml FeCl3 5%
Cách tiến hành: Lấy 0,01g cặn các dịch chiết cho vào ống nghiệm thêm
vào 1ml dung dịch 1, lắc đều cho tan hết, nghiêng ống nghiệm và cho từ từ 1ml dung dịch 2 theo thành ống nghiệm, quan sát sự xuất hiện của màu đỏ hay nâu đỏ, giữa hai lớp chất lỏng. Nếu khơng xuất hiện màu là phản ứng âm tính với các glucosit tim.
2.3.2.6. Định tính các saponin
Chuẩn bị dịch thử như ở mục 2.3.2.1. lấy 2 ống nghiệm mỗi ống cho
2ml dịch thử. Ống 1 cho 1 ml HCl lỗng, ống 2 cho 1 ml NaOH lỗng rồi bịt miệng ống nghiệm, lắc trong vịng 5 phút theo chiều dọc, quan sát sự xuất hiện và mức độ bền vững của bọt. Nếu bọt cao quá 3 - 4 cm và bền trên 15 phút là phản ứng dương tính.
2.3.2.7. Định tính các tanin
Cân lấy 0,01g cặn chiết, thêm 10ml metanol nước cất, khuấy đều rồi nhỏ 2-3 giọt FeCl3 5%, nếu cĩ màu xanh hoặc lục hoặc đen là phản ứng dương tính.
Kết quả phân tích định tính các nhĩm chất trong cây Schisandra perulata, được nêu trong bảng 2.2.
Bảng 2.2. Kết quả định tính các nhĩm chất trong cây Schisandra perulata
STT Nhĩm
chất Thuốc thử Hiện tượng
Cặn tổng 1 Sterol Lieberman- Bourchardt Màu xanh Màu vàng +
2 Ancaloit Dragendorff Vàng da cam _ Zn(Mg) + HCl Dung dịch nhạt màu dẫn đến màu đỏ nhạt + H2SO4 đặc Hồng nhạt + NaOH đặc Vàng + 3 Flavonoit FeCl3 5% Xanh thẫm +
4 Cumarin Phản ứng tạo kết tủa
bơng Cĩ kết tủa _
5 Glucosit trợ tim
FeCl3 trong
CH3COOH +H2SO4đ Vàng nâu rõ _ 6 Saponin Phản ứng tạo bọt Bọt bền trong NaOH +
7 Tanin FeCl3 Màu xanh +
Chú giải : + : Phản ứng dương tính ─ : Phản ứng âm tính
2.4. Phân lập và tinh chế các chất
2.4.1. Cặn dịch chiết n-hexan của cây Ngũ vị vảy chồi (SPH)
Dịch chiết n-hexan làm khan bằng Na2SO4, sau đĩ cất loại dung mơi dưới áp suất giảm, thu được 51,1g bột thơ. Lấy 25,2g cặn chiết n-hexan đem
axetat, etyl axetat (0-100% EtOAc), và metanol thu các phân đoạn từ sắc ký cột ở những thể tích nhỏ (510ml/phân đoạn). Kiểm tra các phân đoạn thu được bằng sắc ký lớp mỏng (SKLM) và hiện màu bằng thuốc thử vanilin - H2SO4 5%, sau đĩ các phân đoạn giống nhau được gộp lại rồi đuổi kiệt dung mơi.
2.4.1.1. Hợp chất β-sitosterol (SPH1)
Rửa giải cột bằng hệ dung mơi n-hexan - etyl axetat (30:1), thu được
khối chất rắn vơ định hình, kết tinh lại trong n-hexan đã thu được tinh thể
hình kim khơng màu (65,7 mg), điểm chảy 138-140 0C.
EI-MS (m/z): 414 [M]+. IR (νmax , cm-1): 3431,5 (dao động hĩa trị OH), 2931,3 (dao động hĩa trị CH); 1647,2 (C=C). 1H-NMR (500M Hz, CDCl3) δ (ppm): 3,51 (1H, m, H-3); 5,31 (1H, dd, J = 5; 2 Hz, H-6); 1,01 (3H, s, H-18); 0,92 (3H, d, J = 6,6 Hz, H-21); 0,85 (3H, d, J = 7,1 Hz, H-26); 0,84 (3H, d, J = 6,6 Hz, H-29); 0,81 (3H, d, J = 6,6 Hz, H-28); 0,68 (3H, s, H-19). 13C- NMR (125M Hz, CDCl3) δ (ppm): 37,3 (C-1); 31,7 (C-2); 71,8 (C-3); 42,3 (C-4); 140,8 (C-5); 121,7 (C-6); 31,9 (C-7); 31,9 (C-8); 50,2 (C-9); 36,5 (C- 10); 21,1 (C-11); 39,8 (C-12); 42,3 (C-13); 56,8 (C-14); 24,3 (C-15); 28,3 (C- 16); 56,1 (C-17); 11,9 (C-18); 19,4 (C-19); 36,2 (C-20); 18,8 (C-21); 33,9 (C- 22); 26,1 (C-23); 45,9 (C-24); 29,2 (C-25); 19,1 (C-26); 19,4 (C-27); 23,1 (C- 28); 12,0 (C-29). 2.4.1.2. Hợp chất (7S,8R,8’R,7’R)-3,4,3’,4’-dimethylene dioxy-7,7’- epoxylignan(SPH2)
Rửa giải cột bằng hệ dung mơi n-hexan-etyl axetat (30:1), thu được khối chất vơ định hình. Đem kết tinh lại trong dung mơi axeton thu được chất tinh thể hình kim, khối lượng 71,6 mg, điểm chảy 115-117 0C, RfA= 75.
FT-ICR/MS (m/z): 341,17523 [M+H]+. 1H-NMR (500MHz, CDCl3, TMS, δ ppm): 6,91 (2H, d, J=1,5 Hz, H-5,5’); 6,81 (2H, dd, J=8,4 và 1,5 Hz, H-6,6’); 6,77 (2H, d, J=8,4 Hz, H-2,2’); 5,94 ( s, H-10,10’); 5,398 và 4,612
(1H, d, J= 4,5 và 9,5 Hz, H-7,7’); 2,42 và 2,38 (1H, m, H-8,8’); 0,994 và 0,621 ( 1H, d, J= 6,5 và 7,0 Hz, H-9,9’). 13C-NMR (125MHz, CDCl3, TMS, δ ppm): 137,1 và 134,6 (C-1,1’); 119,5 và 119,0 (C-2,2’); 147,8 và 147,5 (C-3,3’); 146,9 và 146,3 (C-4,4’); 106,8 và 106,5 (C-5,5’); 108,0 và 107,9 (C-6,6’); 85,7 và 84,7 (C-7,7’); 47,5 và 43,4 (C-8,8’); 11,8 và 9,4 (C-9,9’). 2.4.1.3. Hợp chất 3,4-dimetoxy-3’,4’-metylendioxi-7,7’-epoxi-lignan (SPH3)
Rửa giải cột bằng hệ dung mơi n-hexan-etyl axetat (20:1), thu được
khối chất vơ định hình. Đem kết tinh lại trong dung mơi axeton thu được chất tinh thể hình kim, khối lượng 52,8 mg, điểm chảy 136-137 0C, RfA= 75.
1 H-NMR (500MHz, CDCl3, TMS, δ ppm): 6,85 (2H, d, H-5,5’); 6,82 (2H, dd, H-6,6’); 6,77 (2H, d, H-2,2’); 5,94 (s, H-10); 5,94 và 5,93 (s, H- 10’,11’); 5,43 và 4,65 (1H, d, H-7,7’); 2,45 và 2,41 (1H, m, H-8,8’); 0,88 và 0,622 ( 1H, d, H-9,9’). 13C-NMR (125MHz, CDCl3, TMS, δ ppm): 135,5 và 134,7 (C-1,1’); 119,0 và 118,5 (C-2,2’); 149,1 và 148,5 (C-3,3’); 147,5 và 146,3 (C-4,4’); 107,9 và 106,8 (C-5,5’); 111,0 và 109,2 (C-6,6’); 85,6 và 84,7 (C-7,7’); 47,4 và 43,4 (C-8,8’); 11,8 và 9,5 (C-9,9’); 55,94 (C-10’); 55,87 (C- 11’). 2.4.1.4. Hợp chất 2,3-dihydroxypropyl hexacosanoat (SPH4)
Rửa giải cột bằng hệ dung mơi n-hexan-etyl axetat (3:1), thu được chất vơ định hình, kết tinh lại trong dung mơi clorofom thu được chất bột màu trắng (93 mg), điểm nĩng chảy là 102-105 0C, RfC= 72. 1 H-NMR (500MHz, CDCl3, TMS, δ ppm): 4,11 (2H, m, H-2); 3,88 (1H, t, J=5,0 và 10Hz, H-); 3,64 (1H, dd, J=4,0 và 12,0Hz, H-); 3,54 (1H, dd, J=6,0 và 11,0Hz, H-); 2,35 (2H, t, J=7,5 và 15Hz, H-2’); 1,62 (2H, m, H- 3’);1,26 (45H, m); 0,88 (3H, t, J=6,5 và 13,5Hz, H-23’). 13C-NMR (125MHz, CDCl3, TMS, δ ppm): 174,39 (s, C-1’), 69,78 (d, C-2); 64,97 (t, C-1); 63,03 (t, C-3); 28,94-33,98 (CH2); 24,70 (t, C-3’); 22,47 (t, C-2’); 13,80 (q, C-23’).
2.4.2. Cặn dịch chiết diclometan của cây Ngũ vị vảy chồi (SPD)
Dịch chiết diclometan làm khan bằng Na2SO4, sau đĩ cất loại dung mơi dưới áp suất giảm, thu được 19,0g cặn khơ thơ. Sau khi kiểm tra sắc ký lớp mỏng, lấy 19,0g cặn trên đem tách trên cột silica gel, rửa giải cột bằng hệ dung mơi n-hexan-etyl axetat tăng dần theo độ phân cực (0-100% EtOAc),
dịch rửa giải được thu ở những thể tích nhỏ (510ml/phân đoạn). Kiểm tra các phân đoạn thu được bằng sắc ký lớp mỏng và hiện màu bằng thuốc thử vanilin - H2SO4 5%, sau đĩ các phân đoạn giống nhau được gộp lại rồi đem cất loại dung mơi.
2.4.2.1. Hợp chất axit meso-dihydroguaiaretic (SPD1)
Tiếp tục rửa giải cột bằng dung mơi n-hexan–etyl axetat (20 : 1) thu
được chất vơ định hình, kết tinh lại trong dung mơi axeton thu được chất rắn khơng màu, khối lượng 89,7 mg, nhiệt độ nĩng chảy 87-89 0C và RfB= 65.
FT-ICR/MS (m/z): 331,19095 [M+H]+. 1H-NMR (500MHz, CDCl3, TMS, δ ppm): 6,827/6,819/6,811 (H-5,5’); 6,662/6,658 và 6,646/6,642 (H- 6,6’); 6,61 (2H, d, J=2 Hz, H-2,2’); 3,85 (s, H-3,3’-OMe); 2,303/2,284 và 2,276/2,257 (H-7,7’); 1,771 (m), H-8,8’); 0,845 (6H, d, J=6,5 Hz, H-9,9’). 13 C-NMR (125MHz, CDCl3, TMS, δ ppm): 133,8 (C-1,1’); 111,5 (C-2,2’); 146,3 (C-3,3’); 143,6 (C-4,4’); 114,0 (C-5,5’); 121,7 (C-6,6’); 38,9 (C-7,7’); 39,2 (C-8,8’); 16,2 (C-9,9’); 55,9 (C-3,3’-OMe). 2.4.2.2. Hợp chất 2,3-dihydroxypropyl 28-hydroxyoctacosanoat (SPD2)
Rửa giải cột bằng hệ dung mơi n-hexan-etyl axetat (2:1), thu được chất vơ định hình, kết tinh lại trong dung mơi clorofom thu được chất bột màu trắng (96 mg), điểm nĩng chảy là 108-109 0C, RfC= 65.
1
H-NMR (500M Hz, CDCl3) δ (ppm): 4,12 (m); 3,87 (m); 3,62 (m); 3,57 (2H, s, J=6,5Hz); 2,35 (2H, t, J=7,5 Hz, H-2’); 1,63 (2H, m, H-3’); 1,55 (2H; m; H-27’); 1,30 (2H, m, H-26’); 1,26 (s, broad). 13C-NMR (125M Hz,
CDCl3) δ (ppm): 62,88 (C-1); 69,40 (C-2); 64,90 (C-3); 174,30 (C-1’); 33,83 (C-2’); 24,56 (C-3’); 28,81-29,34 (C-4’-25’); 31,9 25,47 (C-26’); 32,20 (C- 27’); 62,06 (C-28’).
2.4.3. Cặn dịch chiết etyl axetat của cây Ngũ vị vảy chồi (SPE)
Dịch chiết etyl axetat làm khan bằng Na2SO4, sau đĩ cất loại dung mơi dưới áp suất giảm, thu được 49,2g cặn khơ thơ. Sau khi kiểm tra sắc ký lớp mỏng, lấy 49,2g cặn trên đem tách trên cột silica gel, rửa giải cột bằng hệ dung mơi clorofom-metanol tăng dần theo độ phân cực (0-100% metanol), dịch rửa giải được thu ở những thể tích nhỏ (510ml/phân đoạn). Kiểm tra các phân đoạn thu được bằng sắc ký lớp mỏng và hiện màu bằng thuốc thử vanilin - H2SO4 5%, sau đĩ các phân đoạn giống nhau được gộp lại rồi đem cất loại dung mơi.
2.4.3.1. Hợp chất β-sitosterol 3-O-β-D-glucopyranozit (SPE1)
Rửa giải cột bằng dung mơi etyl axetat thu được chất bột vơ định hình, làm sạch khối chất rắn này trong dung mơi etyl axetat rồi kết tinh lại trong metanol thu được chất bột vơ định hình màu trắng cĩ khối lượng 49 mg, nhiệt độ nĩng chảy 269-270oC, RfC= 65.
Phổ EI-MS: m/z (%): 396 [M - C6H12O6]+. FT-IR νmax (cm-1): 3390 (rộng); 2934; 1644; 1461; 1373; 1073; 1026. 1H-NMR (500 M Hz, DMSO-d6) δ (ppm): 3,56 (1H, m, H-3); 5,34 (1H, dd, J = 5; 2 Hz, H-6); 0,65 (3H, s, H-18); 0,93 (3H, s, H-19); 0,94 (3H, d, J = 6,6 Hz, H-21); 0,83 (3H, d, J = 7,1 Hz, H- 26); 0,85 (3H, d, J = 6,6 Hz, H-29); 0,80 (3H, d, J = 6,6 Hz, H-28). Phổ 13C- NMR (125M Hz, DMSO-d6); δ (ppm): 36,3 (t, C-1); 27,9 (t, C-2); 76,8 (d, C- 3); 38,4 (t, C-4); 140,6 (s, C-5); 121,3 (d, C-6); 31,7 (d, C-7); 31,5 (d, C-8); 50,7 (d, C-9); 35,6 (s, C-10); 21,0 (t, C-11); 36,9 (t, C-12); 45,2 (s, C-13); 56,3 (d, C-14); 23,9 (t, C-15); 29,4 (t, C-16); 55,5 (d, C-17); 11,9 (q, C-18); 19,8 (q, C-19); 33,4 (d, C-20); 19,6 (d, C-21); 31,5 (t, C-22); 28,8 (t, C-23);
49,7 (d, C-24); 25,5 (t, C-25); 19,0 (q, C-26); 20,7 (q, C-27); 22,7 (t, C-28); 12,2 (q, C-29); 100,9 (d, C-1'); 77,1 (d, C-3'); 76,8 (d, C-5'); 73,6 (d, C-2'); 70,2 (d, C-4'); 61,2 (t, C-6').
2.4.3.2. Hợp chất 3,5,7,3’,4’-pentahydroxy-flavan (SPE2)
Tiếp tục rửa giải cột bằng dung mơi clorofom-metanol (8 : 1) thu được chất tương đối sạch, sau đĩ được tinh chế tiếp trên cột RP-18 với dung mơi rửa giải methanol-nước (1:1). Đem kết tinh lại trong dung mơi metanol thu được chất vơ định hình, màu nâu đỏ, cĩ khối lượng 11mg, RfD=80.
1 H-NMR (500MHz, CD3OD, TMS, δ ppm): 6,87 ( d, J = 2Hz, H-12); 6,80 ( d, J = 8Hz, H-15); 6,75 (2H, dd, J = 2 và 2Hz, H-16); 5,97 (1H, d, J = 2Hz, H-7); 5,89 (1H, d, J = 2,5Hz, H-9); 4,61 (1H, d, J = 7,5Hz, H-2); 4,02 (1H, m, H-3); 3,69 (1H, m, H-2’); 3,62 và 3,55 ( dd, J = 4,5;5Hz và 6;6Hz, H- 1’); 2,88 (m) và 2,54 ( dd, J = 5,5Hz và 5Hz, H-4). 13C-NMR (125MHz, CDCl3, TMS, δ ppm): 82,70 (C-2); 68,70 (C-3); 28,37 (C-4); 100,83 (C-5); 157,43 (C-6); 96,33 (C-7); 157,66 (C-8); 95,53 (C-9); 156,79 (C-10); 132,13 (C-11); 115,24 (C-12); 146,12 (C-13); 146,09 (C-14); 116,12 (C-15); 120,03 (C-16); 64,32 (C-2’); 73,76 (C-4’).
Chương 3
THẢO LUẬN KẾT QUẢ
3.1. Nguyên tắc chung
Để phân lập được các hợp chất trong bất kỳ một thực vật nào mà khơng làm ảnh hưởng tới thành phần hố học cĩ trong nĩ thì trước khi ngâm chiết bằng dung mơi hữu cơ, mẫu thực vật phải được đưa đi khử men ngay sau khi thu mẫu và sấy khơ ở điều kiện thích hợp. Về nguyên tắc, việc ngâm chiết mẫu thực vật cĩ thể tiến hành theo 2 cách phổ biến sau:
1. Chiết và phân lập các hợp chất từ mẫu thực vật bằng các loại dung mơi cĩ độ phân cực tăng dần: ete dầu hoả hoặc n-hexan, clorofom, etyl axetat, metanol hoặc etanol v.v....
2. Chiết tổng bằng các ancol (metanol, etanol) hay hệ dung mơi ancol- nước. Sau đĩ, tiến hành ngâm chiết bằng các loại dung mơi cĩ độ phân cực tăng dần như phương pháp 1 để thu được các dịch chiết cĩ chứa các hợp chất cĩ độ phân cực tương đối giống nhau.
Quá trình ngâm chiết thân cây Ngũ vị vảy chồi (Schisandra perulata) được thực hiện theo phương án 2 (Sơ đồ 2.1).
3.2. Phân lập và nhận dạng các hợp chất cĩ trong các dịch chiết khác nhau của cây Ngũ vị vảy chồi
Các dịch chiết từ thân cây Schisandra perulata đều là những hỗn hợp
phức tạp chứa các hợp chất khác nhau. Để phân lập từng chất ra khỏi hỗn hợp, chúng tơi đã sử dụng các phương pháp sắc ký cột như: Cột nhồi silica gel, với các hệ dung mơi rửa giải thích hợp và thường phải lặp lại nhiều lần. Việc tinh chế các chất hay dùng phương pháp kết tinh lại trong dung mơi hoặc hệ dung mơi thích hợp. Nhờ đĩ, sẽ thu được các đơn chất cĩ độ tinh khiết cao, đáp ứng các nhu cầu để khảo sát tính chất hĩa lý và quang phổ của chúng. Đĩ là những yếu tố quan trọng trong quá trình nhận dạng và xác định cấu trúc hĩa học của các chất đã phân lập được từ các đối tượng nghiên cứu nĩi trên.
Việc phân lập các thành phần hĩa học của cây Ngũ vị vảy chồi (Schisandra perulata) đã thu được các hợp chất sạch gồm hai hợp chất steroit:
β-sitosterol (SPH1) và β-sitosterol 3-O-β-D-glucopyranozit (SPE1); hai hợp chất glycerit : 2,3-dihydroxypropyl 28-hydroxyoctacosanoat (SPD2) và 2,3- dihydroxypropyl hexacosanoat (SPH4); ba hợp chất lignan: (7S,8R,8’R,7’R)- 3,4,3’,4’-dimethylene dioxy-7,7’-epoxylignan (SPH2), 3,4-dimetoxy-3’,4’- metylendioxi-7,7’-epoxilignan (SPH3) và axit meso-dihydroguaiaretic
(SPD1); một hợp chất flavonoit : 3,5,7,3’,4’-pentahydroxy-flavan (SPE2).
3.2.1. Các hợp chất sterol
3.2.1.1. Hợp chất β-sitosterol (SPH1)
Hợp chất SPH1 thu được dưới dạng tinh thể hình kim màu trắng từ dịch n-hexan, nĩng chảy ở 138-140 C, điểm nĩng chảy so với chất mẫu khơng thay đổi. Trong các phổ 1H- và 13C-NMR đã chỉ ra sự cĩ mặt của một