Ngồi các hợp chất lignan trên, trong chi Schisandra người ta cịn phân lập được một số hợp chất tecpenoit chủ yếu là các tritecpen lacton và tritecpen lanostan.
1.2.2.1.Các hợp chất tritecpen lacton
Năm 1984, Liu J. và các cộng sự đã phân lập được 4 hợp chất là schisanlacton A (47), schisanlacton B (48), schisanlacton C (49) và schisanlacton D (50) từ cây Schisandra sphenanthera [37].
47. Schisanlacton A
48. Schisanlacton B
49. Schisanlacton C
50. Schisanlacton D
Năm 1984, Li R. và các cộng sự đã tách chiết được hợp chất là
51. Henridilacton D
52.Pre-schisanartanin C
53.Pre-schisanartanin D
Năm 2000, Chun Lei và cộng sự của mình đã phân lập được 2 hợp chất là pre-schisanartanin C (52) và pre-schisanartanin D (53) từ thân và lá cây
Schisandra propinqua [11]. Năm 2001, Chen Y.-G. và các cộng sự đã phân
54. Schiprolacton A
55. Lancifodilacton 56.Lancifodilacton B
Năm 2003, Li R.-T. và cộng sự của mình đã phân lập được hợp chất lancifodilacton A (55) [27] và năm 2004 tách chiết được 4 hợp chất là lancifodilacton B (56), lancifodilacton C (57), lancifodilacton D (58), lancifodilacton E (59) từ cây Schisandra lancifolia [29].
O O O OH O O O O O O O O OH O O O O O 57. Lancifodilacton C 58.Lancifodilacton D 59. Lancifodilacton E
Năm 2003, Li R.-T. và các cộng sự đã phân lập được hợp chất micrandilacton A (60) từ rễ cây Schisandra micrantha [28].
60. Micrandilacton A
Năm 2004, Li R.-T và cộng sự của mình đã phân lập được 3 hợp chất là henridilacton A (61), henridilacton B (62), henridilacton C (63) từ thân và lá cây Schisandra henryi [30].
61. Henridilacton A 62. Henridilacton B
Năm 2005, Xiao W.L. và cộng sự đã phân lập được 3 hợp chất là lancifodilacton F(64), lancifodilacton G (65) và lancifodilacton H (66) [55] và năm 2006 tách chiết được 5 hợp chất là lancifodilacton I (67), lancifodilacton J (68), lancifodilacton L (69), lancifodilacton M (70) và lancifodilacton N (71) từ cây Schisandra lancifolia [56].
64. Lancifodilacton F O O O O O OH O O OH O O OH OH O 65. Lancifodilacton G 66. Lancifodilacton H 67. Lancifodilacton I 68. Lancifodilacton J
69. Lancifodilacton L 70. Lancifodilacton M
71. Lancifodilacton N
Năm 2006, Xiao W.-L. và các cộng sự đã phân lập được 2 hợp chất là rubriflordilacton A (72), rubriflordilacton B (73) từ thân và lá của cây
Schisandra rubriflora [59].
72. Rubriflordilacton A 73. Rubriflordilacton B
Năm 2006, Xiao W.-L. và các cộng sự của mình đã phân lập được 2 hợp chất đĩ là sphenadilacton A (74) và sphenadilacton B (75), từ quả cây
Schisandra sphenanthera [57], [58] và năm 2009 đã phân lập được 2 chất schilancidilacton A (76), schilancidilacton B (77) ở Schisandra chinensis [54].
74. Sphenadilacton A 75. Sphenadilacton B
76. Schilancidilacton A
Năm 2007, Lei C. và cộng sự đã tách chiết được 4 hợp chất là propindilacton A (78), propindilacton B (79), propindilacton C (80) và propindilacton D (81) từ quả và thân của cây Schisandra propinqua [24].
78. Propindilacton A 79. Propindilacton B
80. Propindilacton C 81. Propindilacton D
Năm 2007, Xiao W.-L. và các cộng sự đã phân lập được 6 hợp chất là rubriflorin A (82), rubriflorin B (83), rubriflorin C (84) , rubriflorin D (85), rubriflorin E (86), rubriflorin F (87) từ cây Schisandra rubriflora [60], [61].
84. Rubriflorin C
85. Rubriflorin D
86. Rubriflorin E
1.2.2.2. Các hợp chất tritecpen khung lanostan
Năm 1972, Kikuchi M. và các cộng sự đã phân lập được hợp chất axit nigranoic (88) từ thân lá cây Schisandra sphaerandra và Schisandra nigra [20].
88. Axit nigranoic
Năm 1976, Takahashi K. và các cộng sự đã phân lập được hợp chất là axit isoshisandrolic (89) từ thân và lá cây Schisandra chinensis và Schisandra
propinqua [47].
89. Axit isoschizandrolic
Năm 1988, Liu J.S. và các cộng sự đã phân lập được 2 hợp chất là 12-
axit anwuweizic (90), axit anwuweizonic (91) từ thân và lá cây Schisandra
henryi [38].
91. Axit anwuweizonic
Năm 1989, Lian-niang L. và các cộng sự đã phân lập được hợp chất là axit manwuweizic (92) từ thân và lá cây Schisandra propinqua [34].
92. Axit manwuweizic
Năm 1989, Yue J.-M. và các cộng sự đã phân lập được hợp chất là
schisanol (93) từ rễ cây Schisandra sphenanthera [71].
93. Schisanol
Năm 2006, Xiao W.-L. và các cộng sự đã phân lập được hợp chất axit lancifoic(94) từ thân và lá cây Schisandra lancifolia [57].
94. Axit lancifoic
Năm 2012, Nguyễn Quyết Tiến và các cộng sự đã phân lập được hợp chất axit kadsuric(95) từ thân của cây Schisandra sphenanthera [4].
95. Axit kadsuric
1.3. Hoạt tính sinh học của các hợp chất tritecpenoit và lignan
Những nghiên cứu về hoạt tính sinh học của dịch chiết các lồi thuộc chi Schisandra đã cho những kết quả rất đáng quan tâm. Điều đáng chú ý là hoạt tính lại tập trung ở các hợp chất lignan, chủ yếu là các chất cyclolignan và các hợp chất tecpenoit, chủ yếu là các chất tritecpenoit cho nhiều kết quả rất thú vị như hoạt tính anti-HIV, chống viêm gan B (anti-HbsAg, anti- HbeAg), hoạt tính chống ung thư, chống oxy hĩa,…
1.3.1. Hoạt tính sinh học của các hợp chất tritecpenoit
Các hợp chất tritecpenoit phân lập được từ thiên nhiên rất phong phú và đa dạng với nhiều bộ khung khác nhau. Nhiều chất cĩ hoạt tính rất cĩ giá trị trong việc nghiên cứu tìm kiếm các chất cĩ triển vọng ứng dụng để tổng hợp
những dẫn xuất làm thuốc đáp ứng trong cuộc sống của con người. Nhiều hợp chất tritecpen khung ursan, lupan, khung olean, khung lanostan và các hợp chất vịng lacton cĩ hoạt tính rất thú vị cũng đã được nhiều nhà khoa học quan tâm đến như hoạt tính chống viêm gan, chống khối u và anti-HIV.
Hợp chất micrandilacton C được phân lập từ cây Schisandra micrantha với giá trị EC50= 7,71 g/ml (SI>25,94) chống lại sự lây lan HIV-1 và khả năng gây độc tối thiểu. Với tác dụng và cấu tạo độc đáo micrandilacton C được kỳ vọng là sự đột phá trong điều trị HIV [28].
Micrandilacton C
Ngồi ra một số tritecpenoit lancifodilacton H, axit lancifoic A, axit nigranoic phân lập từ thân và lá của lồi Schisandra lancifolia [50]; Hai hợp chất sphenadilacton A-B được phân lập từ lá và thân của cây Schisandra sphenanthera [56]; hợp chất schinarisanlacton A phân lập từ quả lồi Schisandra arisanensis cĩ hoạt tính anti-HIV-1 [70].
Axit nigranoic Sphenadilacton A
Schinarisanlacton A Sphenadilacton B
Một số hợp chất secquitecpen như schisanwilsonen A-C phân lập từ quả lồi Schisandra wilsoniana được chứng minh cĩ tác dụng kháng virus viêm gan B (anti-HbsAg và anti-HbeAg) đến 76,5% và 28,9% [19]; Hai hợp chất tritecpenoit là henrischinin A-B được phân lập từ lá và thân của cây
Schisandra henryi cĩ khả năng gây độc yếu với tế bào bạch cầu HL-60 [69].
Schisanwilsonen A-C (1-3) Henrischinin A-B (1-2)
Hai hợp chất schigrandilacton A-C phân lập từ cây Schisandra grandiflora cĩ tác dụng gây độc tế bào với hai dịng ung thư gan ở người, hợp
chất schigrandilacton C cịn cho thấy tác dụng ức chế sự phát triển của siêu vi HIV-1 trên các tế bào cấy dịng C8166, phương thức này cĩ thể giúp giữ siêu vi khuẩn HIV-1 ở trạng thái ngưng hoạt động [62].
Schigrandilacton A Schigrandilacton C
Một số hợp chất tritecpenlacton (1-5) phân lập từ quả cây Schisandra
arisanensis cĩ hoạt tính kháng virus HSV-1 và ức chế sự sản xuất anion peroxit
của bạch cầu trung tính [43].
Hai hợp chất sphenalacton A và sphenalacton D đã được phân lập từ lá và thân cây của Schisandra sphenanthera cho thấy hoạt tính anti-HIV-1 với giá trị EC50 trong khoảng 35,5-89,1 μg/ml và cĩ khả năng gây độc thấp hơn so với tế bào C8166 (CC50 > 200 μg/ml) [51], [52].
Sphenalacton A Sphenalacton D
1.3.2. Hoạt tính sinh học của các hợp chất lignan
Schisantherin D phân lập từ cây Schisandra viridis cĩ tác dụng ức chế virus HIV in vitro đối với tế bào bạch huyết H9. Schisantherin D thể hiện hoạt tính anti-HIV mạnh với giá trị EC50= 0,5g/ml và hệ số trị liệu (TI) 50,6 [17]; Hai hợp chất rubrisandrin A-B phân lập từ quả của cây Schisandra rubriflora [42] ; ba hợp chất dibenzocyclooctadien lignan marlignan A-C được phân lập từ thân của cây Schisandra wilsoniana [14] với hai hợp chất tiegusanin A và tiegusanin G đã được phân lập từ cây Schisandra propinqua var sinensis đều
cĩ hoạt tính anti- HIV-1, tiegusanin G cĩ hoạt tính anti-HIV-1 với EC 50= 7,9
Schisantherin D Rubrisandrin A Rubrisandrin B
Marlignan A-C (1 - 3)
Tiegusanin A Tiegusanin G
Ngồi ra, từ dịch chiết cồn của quả cây Schisandra chinensis người ta
cũng đã phân lập được các neolignan. Các hợp chất neolignan này được kiểm tra khả năng chống khối u in vitro, ức chế kháng nguyên virus Epstein-Barr
(EBV-EA) trên dịng tế bào Raji. Kết quả cho thấy tất cả các chất đều cĩ khả năng ức chế EBV-EA mà khơng gây độc trên dịng tế bào Raji. Trong đĩ hợp
chất schisandrin C cĩ hoạt tính [41]; Dịch chiết từ quả Schisandra chinensis
cịn cĩ tác dụng ức chế sự chuyển hĩa acyl cholesterol trên gan thỏ và người ta đã phát hiện hợp chất gomisin N được phân lập từ lồi này cĩ khả năng ức chế ACAT trên gan thỏ với giá trị IC50=25M; schisanhenol được phân lập từ một số lồi thực vật Schisandra chinensis và Schisandra rubriflora cĩ hoạt tính chống oxy hĩa, chống peroxy hĩa lipit [32].
Schisandrin C Gomisin N Schisanhenol
Hai hợp chất taiwanschirin C và schizarin A được phân lập từ cây
Schizandrarisanensis gây độc tế bào chống lại ung thư gan hepatoma (Hepa-
3B, ED 50= 2,2 g /ml với taiwanschirin C và ED 50= 4.2 g /ml với schizarin
A) . Hợp chất schizarin A cịn cho thấy hoạt tính chống lại ung thư ruột kết (Colo-205, ED 50= 2,9 g /ml) [66].
Bốn C19 khung homolignan 5,4’-butano-2,4-cyclohexadienone-6-spiro- 3’-(2’,3’-dihydrobenzo[b]furan); schiarisanrin A-C và schiarisanrin C, phân lập từ cây Schizandra arisanensis cĩ hoạt tính gây độc tế bào tương ứng với ED50 = 0,36; 7,1; 4,9 và 5,7 μg/ml, chống lại ung thư vịm họng (NPC), ung thư ruột kết (Colo-250), ung thư gan (HEPA hepatoma) và các tế bào ung thư cổ tử cung (Hela) [67].
Chương 2 THỰC NGHIỆM
2.1. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu
2.1.1. Thu mẫu cây, xác định tên khoa học và phương pháp xử lý mẫu
Nguyên liệu để nghiên cứu là cây Ngũ vị vảy chồi. Mẫu tươi được thu hái vào tháng 08/2012 tại Sapa, Lào Cai.
Mẫu cây đem nghiên cứu hố thực vật được TS. Bùi Văn Thanh, Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật, Viện Hàn lâm Khoa học và Cơng nghệ Việt Nam xác định tên khoa học là Schisandra perulata Gagnep., thuộc họ Ngũ vị (Schisandraceae).
Hình 2.1. Cây Ngũ vị vảy chồi Hình 2.2. Quả Ngũ vị vảy chồi
Mẫu thân tươi (10kg) được khử men trong tủ sấy 10 phút ở nhiệt độ 110 oC, sau đĩ được sấy khơ đến khối lượng khơng đổi (độ ẩm < 10%) ở nhiệt độ 60 oC thu được (2,5kg) mẫu khơ.
2.1.2. Phương pháp ngâm chiết và phân lập các hợp chất từ dịch chiết
Mẫu khơ (2,5kg) đem nghiền nhỏ, cho vào bình ngâm chiết với metanol ở nhiệt độ phịng trong thiết bị siêu âm cho đến khi nhạt màu (5 x 6l = 30l
metanol). Các dịch chiết gom lại và làm khơ bằng natri sunfat (Na2SO4) khan. Sau khi lọc qua giấy lọc, dịch chiết thu được được cất loại dung mơi bằng máy cất quay (T < 50 0C) dưới áp suất giảm, cặn chiết thu được đem chiết phân đoạn lần lượt bằng các loại dung mơi cĩ độ phân cực tăng dần (n-hexan, diclometan, etyl axetat). Sau đĩ, đuổi kiệt dung mơi và chiết lại cặn cịn lại bằng metanol, thu được 4 cặn tương ứng lần lượt là n–hexan (SPH), diclometan (SPD), etylaxetat (SPE) và metanol (SPM).
Để phân lập các chất sạch từ hỗn hợp các chất cĩ trong từng loại cặn dịch chiết, các phương pháp sắc ký (Sắc ký lớp mỏng (SKLM), Sắc ký cột thường Silica gel Merck 63-200 nm, với các dung mơi và hệ dung mơi thích hợp) đã được sử dụng phối hợp cùng các phương pháp kết tinh phân đoạn và kết tinh lại.
Quá trình nghiên cứu sẽ nêu chi tiết ở phần thực nghiệm.
2.1.3. Phương pháp xác định cấu trúc hố học các chất phân lập được
Các chất phân lập được ở dạng tinh khiết là đối tượng để khảo sát các đặc trưng vật lý: màu sắc, mùi, dạng thù hình, thời gian lưu Rf, điểm nĩng chảy (0C), đo độ quang hoạt (αD) v.v.. Sau đĩ, tiến hành ghi các phổ tử ngoại (UV-VIS), phổ hồng ngoại (FT-IR), phổ khối lượng (MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều proton (1H-NMR), cacbon-13 (13C-NMR), phổ DEPT, phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều HSQC và HMBC với các kỹ thuật khác nhau tuỳ theo đối tượng cụ thể. Các số liệu hĩa lý thực nghiệm của các chất sạch được dùng xác định cấu trúc hố học của chúng.
2.2. Dụng cụ, hĩa chất và thiết bị nghiên cứu 2.2.1. Dụng cụ, hĩa chất 2.2.1. Dụng cụ, hĩa chất
Các dung mơi để ngâm chiết mẫu đều dùng loại tinh khiết (pure), khi dùng cho các loại sắc ký cột, sắc ký lớp mỏng, sắc ký lớp mỏng điều chế sử dụng loại tinh khiết phân tích (p.a).
Sắc ký lớp mỏng tự chế với các kích thước khác nhau đã dùng loại silicagel G60 của hãng Merck tráng trên tấm thuỷ tinh và hoạt hĩa ở nhiệt độ 120 0C thời gian từ 6 giờ đến 8 giờ. Sắc ký lớp mỏng đế nhơm tráng sẵn Kieselgel 60F254 độ dày 0,2 mm (Art. 5554).
Các hệ dung mơi triển khai SKLM:
STT Hệ dung mơi (Tỉ lệ thể tích) Kí hiệu
1 n-Hexan - EtOAc (4 : 1) hệ A
2 n-Hexan - EtOAc (2 : 1) hệ B
3 Clorofom - metanol (9 : 1) hệ C 4 Clorofom - metanol (2 : 1) hệ D
Các sắc ký lớp mỏng (SKLM) được soi dưới đèn tử ngoại ở 254 nm (cho loại kieselgel 60F254), sau đĩ phun thuốc thử vanilin - H2SO4 5% và sấy ở trên 100 oC, để phát hiện các hợp chất.
Các giá trị Rf trong hệ dung mơi triển khai biểu thị là Rf A (B, C, D)x100. Sắc ký cột thường sử dụng silica gel Merck 60, cỡ hạt 70-230 mesh (0,040 - 0,063 mm) và 230-400 mesh (0,063 - 0,200 mm).
2.2.2. Thiết bị nghiên cứu
Nhiệt độ nĩng chảy đo trên kính hiển vi Boёtus (Đức) hoặc trên máy Electrothermal IA-9200.
Phổ IR được ghi trên máy IMPACT 410 sử dụng đĩa nén tinh thể KBr. Phổ MS đo trên máy Varian-FT-ICR/HRMS của Viện hĩa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Cơng nghệ Việt Nam.
Phổ cộng hưởng từ nhân (NMR) được đo trên máy Bruker AM500 FT- NMR Spectrometer, Viện Hĩa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Cơng nghệ Việt Nam.
2.3. Thu nhận các dịch chiết từ cây Ngũ vị vảy chồi 2.3.1. Thu nhận các dịch chiết 2.3.1. Thu nhận các dịch chiết
Mẫu thân cây tươi mới thu hái được sấy khơ đem nghiền nhỏ rồi ngâm kiệt với metanol ở nhiệt độ phịng cho đến khi nhạt màu. Dịch chiết được cất loại dung mơi bằng máy cất quay ở nhiệt độ thấp và áp suất giảm. Cặn dịch chiết metanol được chiết lần lượt với n-hexan, diclometan, etylaxetat, metanol và thu được các cặn chiết tương ứng, sau khi đuổi hết dung mơi cho các cặn tương ứng là SPH (cặn n-hexan), SPD (cặn diclometan), SPE (cặn EtOAc) và
SPM (cặn metanol). Việc thu nhận các dịch chiết từ cây Ngũ vị vảy chồi (Schisandra perulata) theo sơ đồ sau:
Các phân đoạn dịch chiết nĩi trên được làm khan bằng Na2SO4, lọc qua giấy lọc rồi cất kiệt dung mơi dưới áp suất giảm, cặn được sấy khơ và cân đến khối lượng khơng đổi. Như vậy, từ cây Schisandra perulata thu
được 4 loại cặn chiết được ký hiệu lần lượt là: SPH, SPD, SPE và SPM.
Ở đĩ: SPH: Cặn chiết n-Hexan của cây Schisandra perulata
SPD: Cặn chiết CH2Cl2 của cây Schisandra perulata
SPE: Cặn chiết EtOAc của cây Schisandra perulata
SPM: Cặn chiết MeOH của cây Schisandra perulata
Kết quả thu nhận các dịch chiết từ cây Ngũ vị vảy chồi ở Sapa, Lào Cai được nêu trong bảng 2.1.
Bảng 2.1. Khối lượng các cặn chiết thu được từ cây
Schisandra perulata
Khối lượng cặn chiết thu được (g) từ 312,1 g cặn MeOH đem chiết Mẫu thu vào tháng 08/2012 Khối lượng mẫu khơ (g) Khối lượng cặn metanol tổng
(g) n-hexan CH2Cl2 EtOAc MeOH
Thân 2500 312,1 51,1 ( SPH) 19,0 (SPD) 49,2 ( SPE) 163 (SPM) 2.3.2. Khảo sát định tính các dịch chiết 2.3.2.1. Phát hiện các hợp chất sterol
Lấy 0,01g cặn của các phân đoạn, thêm 2 ml dung dịch NaOH 10% đun cách thủy đến khơ. Hồ tan cặn trong 3 ml clorofom - lấy dịch clorofom để làm phản ứng định tính các sterol và thuốc thử Lieberman - Bourchardt (gồm hỗn hợp 1 ml anhydrit axetic + 1 ml cloroform để lạnh ở 0 0C, sau đĩ cho
thêm 1 giọt H2SO4 đậm đặc). Lấy 1 ml dịch clorofom rồi thêm 1 giọt thuốc thử, dung dịch xuất hiện màu xanh trong 1 thời gian là phản ứng dương tính.
2.3.2.2. Phát hiện các ancaloit
Lấy 0.01g cặn các phân đoạn, thêm 5ml HCl, khuấy đều, lọc qua giấy lọc, lấy vào 3 ống nghiệm, mỗi ống 1ml nước lọc axit.
Ống (1): 1 - 2 giọt dung dịch silicostungtic axit 5%, nếu cĩ tủa trắng và nhiều là phản ứng dương tính.
Ống (2): 1 - 2 giọt thuốc thử Dragendorff , nếu xuất hiện màu da cam là phản ứng dương tính.
Ống (3): 3 - 5 giọt thuốc thử Mayer, nếu xuất hiện tủa trắng là phản ứng dương tính.
2.3.2.3. Phát hiện các flavonoit
Lấy 0,01g cặn của các phân đoạn, thêm 10ml metanol, đun nĩng cho tan và lọc qua giấy lọc. Lấy 2ml nước lọc vào ống nghiệm, thêm một ít bột magiê