2.3.1. Phƣơng pháp lấy mẫu khí
- Sử dụng máy lấy mẫu khí cá nhân Kimoto của Nhật để lấy mẫu ngoài không khí. Máy được đặt ở độ cao đồng nhất cách mặt đất 1,5m.
- Điểm lấy mẫu được bố trí ở nơi trống, thoáng gió từ mọi phía, khoảng cách giữa các điểm lấy mẫu với các vật cản (nhà cao tầng, cây cao…) đảm bảo cho góc tạo thành giữa đỉnh của vật cản với điểm đo và mặt nằm ngang không lớn hơn 30 độ.
- Số lượng mẫu, sự phân bố các điểm lấy mẫu trong khu vực quan tâm được xác định theo các yêu cầu cụ thể nhưng không ít hơn 3 mẫu cho mỗi điểm đo.
Luận văn Thạc sĩ Bùi Thị Kiều Trang
Trường Đại học Khoa học Tự nhiên 39 Khoa Môi trường
- Dung dịch hấp thụ là dung dịch NaHSO4 1% 20mL - Thời gian lấy mẫu là 1 giờ.
2.3.2. Phƣơng pháp lấy mẫu máu
Mẫu máu được Viện Y học Cổ truyền Quân đội lấy từ người lao động trong Nhà máy Thuốc lá Thăng Long và những bệnh nhân điều trị bệnh tại Viện Y học Cổ truyền Quân đội. Hầu hết những người này làm việc tại Nhà máy thuốc lá Thăng Long đến điều trị bệnh và được cho uống thuốc loại bỏ nicotin ra khỏi cơ thể.
Mẫu máu được tiến hành lấy theo đúng quy định của Bộ Y tế về việc lấy máu, tiếp nhận và xử lý máu.
Lựa chọn chất chống đông và ống nghiệm lấy máu:
- Máu toàn phần được lấy vào ống nghiệm có chứa dung dịch chống đông có chứa gốc oxalat
- Ống nghiệm lấy máu làm bằng thủy tinh trung tính, thể tích 10mL có nút đậy kín.
Mẫu máu lấy về chưa phân tích ngay được bảo quản ở nhiệt độ đông lạnh thấp hơn -18ºC.
2.4. Hóa chất, dụng cụ và các thiết bị phân tích 2.4.1. Hóa chất 2.4.1. Hóa chất
- Dung môi: n-hexan, dung dịch NaHSO4 1%, - Nước cất hai lần,
- Khí N2 (99,99%),
- Dung dịch nicotin chuẩn, 20 ng/mL, - Dung dịch tricloaxetic axit 50%, - Dung dịch photphoric axit50%, - Dung dịch kẽm hydroxit 10M, - Dung môi Clorofom,
Luận văn Thạc sĩ Bùi Thị Kiều Trang
- Dung môi etylaxetat, - Tinh thể NaCl, NaOH, - Dung dịch amoni oxalat.
2.4.2. Dụng cụ thí nghiệm và thiết bị
Dụng cụ:
- Các loại pipet 5mL, 10mL
- Các loại kim bơm mẫu, hút mẫu Hamilton 10µL, 50µL - Các ống nghiệm loại 30mL của Đức
- Phễu chiết lỏng - lỏng. - Giấy lọc Whatman No.1.
Thiết bị:
- Máy GC/ECD và GC/MS của hãng Agilent, Hoa Kỳ, - Tủ sấy, tủ lạnh,
- Cân phân tích (độ chính xác 0,001mg) mettler, Thụy Sỹ, - Máy cô quay chân không Buchii, Đức,
- Máy lấy mẫu không khí Kimoto của Nhật.
2.5. Thực nghiệm
Quá trình tiến hành thực nghiệm được thực hiện tại phòng nghiên cứu độc chất thuộc Trung tâm Giáo dục và Phát triển sắc ký - Đại học Bách Khoa Hà Nội. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
2.5.1. Điều kiện vận hành máy sắc ký khí với detectơ cộng kết điện tử (GC/ECD) để xác định hàm lƣợng nicotin trong mẫu khí tử (GC/ECD) để xác định hàm lƣợng nicotin trong mẫu khí
Để xác định hàm lượng nicotin trong mẫu khí, điều kiện vận hành máy được lựa chọn như sau:
Cột mao quản BD-5:
Dài 30m,
Luận văn Thạc sĩ Bùi Thị Kiều Trang
Trường Đại học Khoa học Tự nhiên 41 Khoa Môi trường
Độ dày của film 0,25µm,
Nhiệt độ cột 700C/phút, 100C/phút, 1000C, 50C/phút, 280ºC.
Detector(ECD): Nhiệt độ 280ºC,
Make flow: 40 mL/phút, Injector: Nhiệt độ: 2500C
Chế độ bơm mẫu Splitless 1 phút Tổng dòng 21,2 mL/phút
Purge flow: 3 mL/phút
Dòng đi qua cột: 1,14 mL/phút Split Ratio: 15 mL/phút
Khí mang: Nitơ, 99,999%.
2.5.2. Điều kiện vận hành máy sắc ký khí với detectơ khối phổ (GC/MS) để phân tích hàm lƣợng nicotin trong mẫu máu (GC/MS) để phân tích hàm lƣợng nicotin trong mẫu máu
Để phân tích nicotin trong huyết thanh lựa chọn phương pháp sắc ký khí khối phổ với các thông số vận hành được lựa chọn như sau:
- Detector: Khối phổ, nhiệt độ buồng khối phổ 260ºC - Cột mao quản Rtx50: Dài 30m,
Đường kính 0,32mm, Độ dày lớp phim 0,25µm. - Chế độ bơm mẫu
- Tốc độ dòng qua cột: 1,2 mL/phút - Nhiệt độ buồng bơm mẫu: 230ºC
Chương trình lên nhiệt độ cột phân tích như sau: 70ºC giữ 1 phút, 10ºC/1 phút, 110ºC, 5ºC/1 phút, 180ºC
Luận văn Thạc sĩ Bùi Thị Kiều Trang
2.5.3. Điều kiện lấy mẫu khí
Lấy mẫu là bước quyết định đến kết quả phân tích. Mẫu lấy đảm bảo không đưa thêm chất ô nhiễm vào mẫu. Các mẫu khí được lấy, bảo quản, vận chuyển và xử lý trong phòng thí nghiệm. Thời gian bảo quản mẫu trong tủ lạnh tối đa là 7 ngày. Tổng cộng có 25 mẫu được lấy trong tháng 4 năm 2011. Các mẫu được lấy xung quanh cơ sở sản xuất, các điểm có khả năng ô nhiễm cao. Điều kiện, vị trí và số lượng mẫu được lấy nêu ở Bảng 2.1 và Bảng 2.2.
Bảng 2.1. Điều kiện và vị trí lấy mẫu khí tại Trường Đại học Khoa học Tự nhiên
Kí hiệu mẫu
Vị trí lấy Thời gian lấy Điều kiện thời tiết M1 Trước cửa phòng 413 T1 14-15h ngày 31/3 Trời vừa tạnh mưa
M2 Trước cửa phòng 416 T1 16-17h ngày 31/3 Trời vừa tạnh mưa
M3 Trước cửa phòng 421 T1 15-16h ngày 1/4 Trời nắng ráo
M4 332 Nguyễn Trãi 10-11h ngày 2/4 Trời nắng to
M5 336 Nguyễn Trãi 12-13h ngày 2/4 Trời nắng to (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
M6 Trước cửa phòng 404 T4 11-12h ngày 4/4 Trời nắng to
M7 Trước cửa phòng 405 T3 12h-13h ngày 4/4 Trời nắng to
M8 Trước cửa phòng 401 T3 13h-14h ngày 4/4 Trời nắng to
Bảng 2.2. Điều kiện và vị trí lấy mẫu khí tại cơ sở sản xuất thuốc lá Thăng Long, Hà Nội
Kí hiệu
mẫu Vị trí lấy Thời gian lấy
Luận văn Thạc sĩ Bùi Thị Kiều Trang
Trường Đại học Khoa học Tự nhiên 43 Khoa Môi trường
M11 Dây chuyền bao tút số 2 (giữa chuyền) 11-12h ngày 14/4
M12 Khu vưc cấp sợi tầng 3 13-14h ngày 14/4
M13 Đầu băng tải cấp sợi 14-15h ngày 14/4
M14 Khu vực máy cuốn điếu TEX-FF 15-16h ngày 14/4
M15 Gian máy xé điếu 9-10h ngày 15/4
M16 Khu vực máy đóng bao D-T 10-11h ngày 15/4
M17 Khu vực cấp nguyên liệu 11-12h ngày 15/4
M18 Khu vực băng tải cấp nguyên liệu 13-14h ngày 15/4
M19 Khu vực máy sấy sợi cuộng 14-15h ngày 15/4
M20 Khu vực sấy sợi lá 15-16h ngày 15/4
M21 Khu vực phòng điều khiển T3 9-10h ngày 16/4
M22 Trước sân nhà hành chính 10-11h ngày 16/4
M23 Kho nguyên liệu 11-12h ngày 16/4
M24 Trước lò hơi số 2 (cũ) 13-14h ngày 16/4
M25 Trước lò hơi số 2 (mới) 14-15h ngày 16/4 Tất cả các mẫu khí ở Bảng 2.2 được lấy khi trời nắng và lấy trực tiếp trong khu vực nhà máy sản xuất thuốc lá Thăng Long, Hà Nội.
2.5.4. Chuẩn bị mẫu và xử lý mẫu 2.5.4.1. Mẫu khí 2.5.4.1. Mẫu khí
Sử dụng phương pháp chiết lỏng - lỏng với dung môi n-hexan để chiết nicotin, chiết mẫu hai lần mỗi lần sử dụng 10mL n-hexan. Toàn bộ lượng dịch chiết được loại dung môi bằng cô quay chân không cho đến còn khi thể tích 0,5mL, đem mẫu đi phân tích. Nếu chưa phân tích thì mẫu có thể được bảo quản trong tủ lạnh 5ºC và thời gian bảo quản mẫu tối đa 7 ngày.
2.5.4.2. Mẫu máu
Luận văn Thạc sĩ Bùi Thị Kiều Trang
Chuẩn bị 3 mẫu máu có cho sẵn 40ng nicotin. Mỗi mẫu máu được xử lý với 3 loại hoá chất sau: dung dịch 50% photphoric axit, dung dịch 50% tricloaxetic axit, dung dịch kẽm hydroxit 10M.
Hòa tan 3mL máu đã được bảo quản chống đông bằng amoni oxalat vào 9mL nước cất. Thêm 3mL một trong ba dung dịch hoá chất trên vào mẫu. Vừa thêm dung dịch vào mẫu vừa khuấy trộn. Khuấy trộn mẫu thêm 5 phút. Để lắng và lọc mẫu qua giấy lọc Whatman No.1. Dùng pipet lấy 5mL dịch lọc cho vào bình chiết, thêm vào đó 2 gam NaCl, 1 gam NaOH, lắc đều mẫu trong 3 phút.
Chiết 3 lần, mỗi lần với 3mL cloroform. Dùng khí nitơ sạch làm khô mẫu. Hoà tan mẫu vào 10μL etylaxetat để phân tích trên GC/MS và GC/ECD. Độ thu hồi nicotin được nêu trong Bảng 2.3. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Bảng 2.3. Độ thu hồi nicotin tương ứng với 3 loại dung dịch xử lý mẫu
Mẫu Dung dịch dùng để xử lý mẫu Nicotin tìm thấy (ng) Độ thu hồi (%) 1 Kẽm hydroxit 10M 8,45 21,125 8,39 20,975 2 50% tricloaxetic axit 38,73 96,825 38,76 96,9 3 50% photphoric axit 36,45 91,125 39,89 99,725
Với kết quả nêu trên cho thấy khi sử dụng dung dịch tricloaxetic axit 50% để xử lý mẫu sẽ nhận được độ ổn định chiết cao hơn. Do vậy, lựa chọn dung dịch tricloaxetic axit 50% để xử lý mẫu trong suốt quá trình nghiên cứu.
Luận văn Thạc sĩ Bùi Thị Kiều Trang
Trường Đại học Khoa học Tự nhiên 45 Khoa Môi trường
Xác định độ thu hồi nicotin
Hòa tan 3mL máu đã được bảo quản chống đông bằng amoni oxalat vào 9mL nước cất và vừa thêm 3ml dung dịch tricloaxetic axit 50% vào mẫu vừa khuấy trộn. Khuấy trộn thêm 5 phút. Để lắng và lọc mẫu qua giấy lọc Whatman No.1. Dùng pipet lấy 5mL dịch lọc cho vào bình chiết, thêm vào đó 2 gam NaCl, 1 gam NaOH, lắc đều mẫu trong 3 phút.
Chiết 3 lần, mỗi lần với 3mL cloroform. Dùng khí nitơ sạch làm khô mẫu. Hoà tan mẫu vào 10μL etylaxetat để phân tích trên GC/MS và GC/ECD.
Sử dụng phương pháp chuẩn bị mẫu đã nêu để xác định độ thu hồi nicotin sau khi tách chiết. Độ thu hồi nicotin đã được thử nghiệm với các nồng độ khác nhau, và kết quả nhận được nêu trong Bảng 2.4
Bảng 2.4. Độ thu hồi nicotin sau khi tách chiết
Mẫu Nicotin cho vào máu (ng) Nicotin tìm thấy (ng) Độ thu hồi (%)
1 20 18,78 93,9
2 40 38,64 96,6
3 40 38,83 97,075
Điều kiện phân tích GC/MS: chế độ SIM, chọn ion 84.
2.6. Xây dựng đƣờng chuẩn
Đường chuẩn của cotinin được xây dựng dựa trên mối quan hệ giữa nồng độ chất với số đếm diện tích píc của chất đó, và đường chuẩn tuân theo phương trình sau: y = ax + b
Trong đó: x - Nồng độ chất
y - Số đếm diện tích píc của chất
Dung dịch nicotin chuẩn để phân tích hàm lượng nicotin trong mẫu khí
Luận văn Thạc sĩ Bùi Thị Kiều Trang
chất chuẩn có nồng độ từ 5.10-3 - 120.10-3 mg/mL) để xây dựng đường chuẩn đối với mẫu khí. Dung môi pha chuẩn là etylaxetat.
Dung dịch nicotin chuẩn để phân tích hàm lượng nicotin trong máu
Từ dung dịch nicotin gốc nồng độ 20 mg/mL pha thành dung dịch 2 mg/mL. Pha loãng dung dịch bằng etylaxetat để được dãy dung dịch chuẩn có nồng độ nicotin nằm trong khoảng từ 0,5 đến 3 μg/mL. Sử dụng dãy dung dịch này để xây dựng đường chuẩn xác định nicotin trong máu.
2.7. Định tính và định lƣợng nicotin
Để định tính nicotin trong các mẫu, người ta dựa vào thời gian lưu của chất xuất hiện trên sắc đồ so với thời gian lưu của nicotin xuất hiện trên sắc đồ phân tích chuẩn. Nếu thời gian lưu của chất trùng với thời gian lưu của nicotin trong sắc đồ mẫu chuẩn thì có thể kết luận mẫu có nicotin. Luận văn đã sử dụng phương pháp GC/ECD và GC/MS để định tính và định lượng nicotin trong mẫu khí và mẫu máu.
Việc định lượng nicotin trong mẫu được dựa vào thể tích mẫu cuối cùng, số đếm diện tích píc của mẫu và đường chuẩn, trên cơ sở đó tính được nồng độ nicotin trong mẫu phân tích.
Việc định lượng nồng độ nicotin trong các mẫu khí dựa vào công thức sau: X (mg/m3) =
Trong đó:
X: Nồng độ nicotin trong mẫu không khí (mg/m3 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
không khí) Cx: Nồng độ nicotin xác định tính theo đường chuẩn (x 10-3
mg/mL). V: Thể tích cuối của mẫu chiết dùng để phân tích trên GC/ECD (mL).
: Tốc độ dòng lấy mẫu 2 lít/phút = 120 lít/giờ = 120/1000 m3
Việc định lượng lượng nicotin trong các mẫu máu cũng tương tự như đối với mẫu khí, nhưng tính theo phương trình hồi quy thu được từ đường
Luận văn Thạc sĩ Bùi Thị Kiều Trang
Trường Đại học Khoa học Tự nhiên 47 Khoa Môi trường
CHƢƠNG 3.
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. Xây dựng đƣờng ngoại chuẩn của nicotin
3.1.1. Đƣờng ngoại chuẩn xác định nicotin trong mẫu khí
Nicotin trong các mẫu khí được xác định bằng phương pháp GC/ECD. Để khẳng định lại có nicotin trong mẫu thì sử dụng phương pháp GC/MS. Sắc đồ phân tích chất chuẩn nicotin được chỉ ra trong Hình 3.1; ở đây nicotin xuất hiện ở thời điểm 10,226 phút.
Đường chuẩn Hình 3.2 có hệ số tương quan khá cao, trên 99%. Điều đó cho thấy chất chuẩn sử dụng có độ tinh khiết cao và kĩ thuật bơm ổn định. Dựa vào phương trình đường chuẩn Hình 3.2 để tính toán giá trị thực tế của nicotin trong mẫu không khí đã lấy được.
0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 25.0 27.5 30.0 32.5 35.0 37.5 40.0 42.5 45.0 min 0.00 0.25 0.50 0.75 1.00 1.25 1.50 1.75 2.00 2.25 2.50 2.75 3.00uV(x1,000,000) 3 .6 9 0 7 .2 7 0 1 0 .2 2 6
Luận văn Thạc sĩ Bùi Thị Kiều Trang
Chất chuẩn nicotin sử dụng để xây dựng đường ngoại chuẩn có nồng độ từ 5.10-3 - 120.10-3 mg/mL. Số đếm diện tích píc tương ứng với các nồng độ được chỉ ra trong Bảng 3.1 và Hình 3.2.
Bảng 3.1. Số đếm diện tích píc và nồng độ nicotin chuẩn
Nồng độ (x10-3 mg/mL) Số đếm diện tích píc 5 76905,0 20 185407,0 45 396119,0 70 582229,5 90 782518,2 120 961773,8 y = 7886x + 37475 R2 = 0.9968 0 200000 400000 600000 800000 1000000 1200000 0 20 40 60 80 100 120 140 Nồng độ (x10-3 mg/mL) Số đ ếm d iệ n tíc h pi c
Hình 3.2. Đồ thị đường ngoại chuẩn nicotin
Phương trình định lượng nhận được từ đường ngoại chuẩn Hình 3.2 có dạng: y = 7886x + 37475, R2 = 0,996
Luận văn Thạc sĩ Bùi Thị Kiều Trang
Trường Đại học Khoa học Tự nhiên 49 Khoa Môi trường
R là hệ số tương quan
3.1.2. Đƣờng ngoại chuẩn xác định nicotin trong mẫu máu
Nicotin trong các mẫu máu được xác định bằng phương pháp sắc ký khí khối phổ.
Dãy dung dịch chất chuẩn nicotin sử dụng để xây dựng đường ngoại chuẩn có nồng độ từ 0,5 - 3 ng/mL. Số đếm diện tích píc trên phổ đồ tương ứng với các nồng độ nicotin được chỉ ra trong Bảng 3.2 và Hình 3.3.
Bảng 3.2. Số đếm diện tích píc và nồng độ dung dịch nicotin
STT Nồng độ (ng/mL) Số đếm diện tích píc 1 0,5 19894679 2 1,0 37298899 3 1,5 61998787 4 2,0 82670391 5 2,5 96438496 6 3,0 120027601 y = 4E+07x - 154025 R² = 0.997 0 20000000 40000000 60000000 80000000 100000000 120000000 140000000 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5
Nồng độ dung dịch nicotin chuẩn (ng/mL)
S ố đế m d iệ n tíc h pí c
Hình 3.3. Đồ thị đường ngoại chuẩn nicotin (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Luận văn Thạc sĩ Bùi Thị Kiều Trang
Phương trình nhận được từ đường chuẩn trên Hình 3.3 có dạng: y = 4E+07x - 154025, R2 = 0,997
Trong đó: x là nồng độ nicotin (ng/mL)
y là số đếm diện tích píc của nicotin R là hệ số tương quan
3.2. Phân tích nicotin trong không khí
3.2.1. Kết quả phân tích nicotin trong các mẫu khí lấy tại khu vực Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên
Theo cảm quan
Mùi từ thuốc lá ở khu vực Trường Đại học Khoa học Tự nhiên và các