1. Nguyờn tắc
Dựa trờn tớnh chất điện di của cỏc phõn tử chất tan (cỏc ion) trờn nền của dung dịch chất điện ly và chất đệm pH thớch hợp trong ống mao quản, dƣới tỏc dụng của một từ trƣờng điện E xỏc định, đƣợc cung cấp bởi một nguồi thế cao một chiều (10kV-30kV) đặt vào hai đầu mao quản. Việc dựng cột mao quản cú nhiều ƣu việt, nhƣ tốn ớt chất mẫu, tốn ớt hoỏ chất, số đĩa hiệu dụng lớn, quỏ trỡnh tỏch chất nhanh, hiệu quả.
Cơ chế của sự điện di là sự di chuyển khỏc nhau của cỏc phõn tử chất tan (cỏc ion) trong ống mao quản dƣới tỏc dụng của lực điện trƣờng E xỏc định và tớnh chất đặc trƣng của dũng chảy điện thẩm thấu, trong sự phụ thuộc vào điện tớch và kớch thƣớc của nú.
Thế tạo ra từ điện trƣờng E đặt vào hai đầu ống mao quản là rất lớn, thƣờng từ 10kV đến 30kV. Chớnh nú là động lực làm cho cỏc phõn tử chất tan di chuyển theo một hƣớng nhất định. Cỏc chất khỏc nhau cú điện tớch và độ lớn khỏc nhau, sẽ di chuyển với tốc độ khỏc nhau, do đú mà tạo sự tỏch sắc ký cỏc chất phõn tớch. Do từ trƣờng điện thế cao mà làm cho tốc độ phõn tớch nhanh, số đĩa hiệu dụng lớn, hiệu suất tỏch cao.
Cột tỏch sắc ký (ống mao quản) thƣờng cú độ dài từ 25cm đến 100cm, đƣờng kớnh trong (ID) là 25 àm đến 100 àm. Song loại đƣờng kớnh trong từ 50àm đến 75àm là thớch hợp nhất. Vỡ hiệu ứng nhiệt nhỏ để khống chế nhiệt độ cho mao quản. Mao quản đƣợc chế tạo từ thuỷ tinh Silica, cú phủ lớp polyme bờn ngoài để làm cho ống mao quản mềm mại. Mao quản cũng cú thể làm bằng polyme nhƣng loại này dễ dón nở. Vỡ thế, trong thực tế ngƣời ta dựng mao quản bằng thuỷ tinh là chớnh. Mao quản cũng cú thể đƣợc nhồi cỏc chất sắc ký của pha tĩnh loại pha thƣờng hoặc pha ngƣợc, nhƣng cú đƣờng kớnh nhỏ (3àm đến 5àm). trong kỹ thuật CEC, pha ngƣợc đƣợc dựng là chủ
yếu, nhƣ loại cú gốc alkyl C8, C18, hay nhõn phenyl. Số đĩa lý thuyết trong cột tỏch CEC là khỏ lớn từ 104
đến 105 đĩa. Sự phỏt hiện cỏc chất trong quỏ trỡnh tỏch sắc ký điện di tuỳ thuộc vào bản chất của cỏc chất phõn tớch. Núi chung, là dựa trờn cơ sở cỏc tớnh chất: Hấp thụ quang của chất, sự phỏt hoặc tắt huỳnh quang của chất, tớnh chất điện hoỏ của chất…
Nguyờn tắc của việc định lƣợng hay phỏt hiện cỏc chất cũng là trờn cơ sở của mối quan hệ tớn hiệu đo của chất phõn tớch với nồng độ của nú theo biểu thức:
H = koCx (15)
Quỏ trỡnh này cũng nhờ cỏc loại detector nhƣ trong kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao nhƣ: Detector UV-VIS, detetor huỳnh quang, detector đo độ dẫn, deteror khối phổ…
2. Sự điện di và sắc ký điện di mao quản hiệu suất cao
Sự tỏch cỏc chất bằng điện di là dựa trờn cơ sở tốc độ di chuyển khỏc nhau của cỏc chất (cỏc ion) cần tỏch trong ống mao quản trờn nền dung dịch đệm pH và chất điện giải phự hợp, dƣới tỏc dụng của từ trƣờng E thớch hợp. Tốc độ di chuyển của cỏc chất (cỏc ion) phõn tớch đƣợc tớnh theo biểu thức sau:
vi = àiE (16)
Trong đú:
-vi: Tốc độ di chuyển của ion chất tan i trong ống mao quản. -ài: Độ điện di của ion chất tan.
-E: Từ trƣờng điện đặt vào hai đầu ống mao quản.
Từ trƣờng điện E phụ thuộc vào điện thế đặt vào hai đầu ống mao quản và đƣợc tớnh theo vol/cm chiều dài. Trong thực tế của kỹ thuật CEC, điện thế này thƣờng trong vựng từ 200V/cm đến 600V/cm. Trong cỏc điều kiện nhất định, thỡ độ di động điện di àion (electrophoresis mobility) gọi ngắn gọn là độ điện di của mỗi phẩn tử chất tan (ion chất tan) là một hằng số đặc trƣng. Độ điện di này đƣợc xỏc định bởi lực của điện trƣờng E đặt vào hai đầu ống mao quản tỏc động lờn cỏc phần tử đú. Song lực này tối thiểu phải bằng và thắng đƣợc lực cản của mao quản. Nghĩa là giỏ trị àe phụ thuộc vào tỉ số:
àe =f( FE/Ff) (17)
Trong đú:
FE : Lực điện di (Electrophoresis Force), và Ff : Lực cản trở (Frictional Force).
Và trong cỏc định luật về điện, chỳng ta cú: Lực điện gõy ra chuyển động của chất trong mao quản:
FE = q.E (18)
Và lực cản của mao quản là;
Trong đú:
-q: Diện tớch của ion. -ri: Bỏn kớnh của ion i.
-vi: Tốc độ di chuyển của ion i.
-η: Độ nhớt của dung dịch trong ống mao quản.
Khi cõn bằng thi hai lực FE và Ff này là bằng nhau, nhƣng ngƣợc chiều nhau (tức là trỏi dấu nhau), theo quy ƣớc, lực di chuyển EE là dƣơng, lực Ff là õm. Do đú ta cú:
q.E = 6πηrivi (20)
Nhƣ thế từ biểu thức (16) và (20) chỳng ta tỡm đƣợc giỏ trị μe là:
μi = q/6πηri (21)
Mặt khỏc theo Stockes và Like thỡ chỳng ta lại cú:
μi = (Z.e)/( 6πηNri) (22)
Với Z là hoỏ trị và e là điện tớch của ion, N là số Avogadro. Biểu thức (21) cho ta thấy độ lớn của đại lƣợng μe phụ thuộc:
- Tỷ lệ thuận với điện tớch của chất phõn tớch (cỏc ion). - Tỷ lệ nghịch với:
+ Độ nhớt của dung dịch đệm điện di η.
+ Độ lớn (bỏn kớnh ri) của ion chất phõn tớch và 6π.
Nghĩa là trong một điện trƣờng E nhất định, thỡ phõn tử nào cú điện tớch lớn và kớch thƣớc nhỏ thi sẽ di chuyển nhanh. Cỏc ion cú cựng điện tớch, thỡ ion nào cú kớch thƣớc nhỏ thỡ di chuyển nhanh hơn. Cỏc ion cú cựng bỏn kớnh, thỡ ion nào cú điện tớch lớn thỡ di chuyển nhanh hơn.
Độ điện di μe của cỏc chất đƣợc xỏc định bằng thực nghiệm trong cỏc điều kiện chuẩn và phần lớn đó đƣợc chỉ ra trong cỏc sỏch về cỏc hằng số hoỏ lý của cỏc chất đú là giỏ trị μe chuẩn tuyệt đối, đƣợc ký hiệu là μeo. Nhƣng trong thực tế của cỏc dung dịch thực trong ống mao quản của cỏc hệ CEC, thỡ khụng phải là trong cỏc điều kiện chuẩn và chỉ duy nhất một chất nghiờn cứu. Nờn ngƣời ta phải xỏc định và thờm vào khỏi niệm độ điện di hiệu lực μef
(efective electrophoresis mobility). Chớnh giỏ trị μef này mới cú ý nghĩa đỳng và phự hợp với thực tế kỹ thuật CEC. Giỏ trị của đại lƣợng μef này ngoài yếu tố bản chất, độ lớn, điện tớch của chất phõn tớch, nú cũn đƣợc quyết định bởi thế (hay điện từ trƣờng E) đặt vào hai đầu ống mao quản và cũng phụ thuộc cả vào một số yếu tố sau:
- Giỏ trị pH của dung dịch đệm điện giải trong mao quản. - Thành phần của chất điện giải và chất đệm.
- Hằng số điện ly Ka ( hay Kb) của chất tan là axit hay bazơ yếu hay phức trong mao quản.
- Chất hoạt động bề mặt, chất phụ gia trung tớnh. - Dung mụi hữu cơ thờm vào pha động điện di…
Trong kỹ thuật HPCEC ngƣời ta cũng dựng khỏi niệm tốc độ điện di tuyến tớnh u (mm/s). Đại lƣợng này cho chỳng ta biết trong một đơn vị thời gian thỡ vựng chất mẫu trong mao quản di chuyển đƣợc một đoạn là bao nhiờu minimet và nhờ đại lƣợng này chỳng ta dễ dàng so sỏnh chất nào đƣợc điện di nhanh, chất nào điện di chậm.
2.1 Dung dịch đệm pH và chất điện giải.
Quỏ trỡnh điện di trong kỹ thuật CE đƣợc thực hiện trong mụi trƣờng của một hệ dung dịch đệm điện giải, dung dịch đệm đúng vai trũ là pha động (mobil phase: MP) bao gồm chất đệm pH và chất điện giải thớch hợp, hoặc chỉ chất đệm pH làm cả hai chức năng. Cỏc chất này cú tỏc dụng duy trỡ dũng điện trong mao quản, dũng điện di thẩm thấu (EOF) và sự chuyển động hay điện di của chất phõn tớch (chất tan). Giỏ trị pH, nồng độ (dung lƣợng đệm), loại dung dịch đệm điện giải cú vai trũ rất quan trọng. Nú xỏc định tớnh chất và đặc trƣng của
- Bề mặt của ống mao quản Silica.
- Sự tồn tại và ổn định độ lớn của lớp điện kộp, thế Zờta.
- Xỏc định sự chuyển động và tớnh bền vững của dũng điện thẩm EOF. - Duy trỡ và ổn định dũng điện trong mao quản.
- Cuối cựng là ảnh hƣởng đến độ điện di của chất tan, tức là hiệu quả của quỏ trỡnh tỏch sắc ký, mà cụ thể ở đõy là chiều cao đĩa lý thuyết H, số đĩa hiệu lực N của ống mao quản, độ sắc nột của pic sắc ký.
Giỏ trị pH của dung dịch đệm trong ống mao quản cú thể làm thay đổi bề mặt của mao quản từ bề mặt anionic đến cationic theo sự thay đổi pH. Vỡ mao quản trờn bề mặt cú cỏc nhúm –OH. Cỏc nhúm –OH này cú thể bị ionic hoỏ (dehydro) theo sự thay đổi tăng pH của dung dịch đệm. Khi pH của dung dịch đệm trong mao quản lớn hơn 5 (pH>5) thi ion H+
trong một số nhúm –OH này bị tỏch ra, làm bề mặt mao quản mang tớnh õm điện (anionic). Nghĩa là bề mặt mao quản bị anionic hoỏ và giỏ trị pH của dung dịch pha động càng cao thỡ qỳa trỡnh này xảy ra càng mạnh. Kết quả là làm cho độ õm điện trong ống mao quản càng lớn, khi pH tăng nhất là pH>8. Cũn ngƣợc lại khi pH<4 thỡ bề mặt mao quản lại bị cationic hoỏ. Mà bề mặt inonic của ống mao quản là yếu tố quyết định sự hỡnh thành và độ lớn của lớp điện kộp và thế Zờta. Nếu bề mặt anionic thỡ nú sẽ lại giữ cỏc ion õm của pha động. Vỡ thế đối với mỗi loại chất phõn tớch trong quỏ trỡnh sắc ký chỉ cú một vựng giỏ trị pH của dung dịch đệm điện di là thớch hợp và trong vựng này hiệu quả sắc ký là tốt nhất.
Trong ống mao quản khi nồng độ chất điện giải tăng, nghĩa là nồng độ cỏc ion (cation và anion) tăng, thỡ thƣờng làm thay đổi, thƣờng làm giảm độ lớn của lớp điện kộp. Lớp điện kộp là một hiện tƣợng sinh ra tất nhiờn trong mao quản. Nú là yếu tố chỳng ta khụng mong muốn. Lớp điện kộp này thƣờng làm
cho vựng mẫu (vựng chất phõn tớch) di chuyển khụng phẳng, qua đú tạo ra sự doóng pic sắc ký và cuối cựng làm giảm hiệu quả tỏch (làm giảm số N hiệu lực của ống mao quản). Trong thực tế ngƣời ta cần tạo cỏc dung dịch đệm điện di phự hợp, để lớp điện kộp này là nhỏ nhất và khụng đổi, nú đủ điều kiện cần thiết để duy trỡ quỏ trỡnh điện di của chất.
Lớp điện kộp và thế Zờta cũng phụ thuộc cả vào lực ion của dung dịch đệm điện di. Yếu tố này liờn quan đến sự hỡnh thành độ lớn và sự tồn tại của lớp điện kộp trờn bề mặt mao quản. Khi lực ion của dung dịch đệm điện di tăng, thỡ lớp điện kộp sẽ bị hẹp lại (bị nộn lại). Do đú làm cho thế Zờta cũng giảm và ảnh hƣởng đến dũng điện di thẩm thấu (EOF).
Độ lớn của thế Zờta (ζ) một cỏch gần đỳng đƣợc xỏc định theo cụng thức
ζ = (4πrDq)/ε (23)
Trong đú:
-ε là hăng số điện mụi của dung dịch
-q là tổng diện tớch dung dịch theo một đơn vị thể tớch
-rD bỏn kớnh hydrat của ion (bỏn kớnh De**) và giỏ trị của nú đƣợc tớnh theo biểu thức sau:
rD = (εkT)/(8πe2I) (24)
Với e là điện tớch của proton: k là hăng số Borzowman: T là nhiệt độ (độ K) và I là lực ion của dung dịch đệm điện di.
Cụng thức (24) cho chỳng ta thấy cỏc định lƣợng, khi nồng độ đệm lớn, tức là giỏ trị lực ion I lớn, thỡ giỏ trị rD giảm, nghĩa là thế Zờta giảm nhƣ trong cụng thức (23) cũng giảm. Đồng thời, khi ion cú điện tớch lớn (gấp 2-3 lần e) thỡ giỏ trị rD cũng giảm đi 2-3 lần.
Ngoài sự ảnh hƣởng đến lớp điện kộp trờn bề mặt mao quản, nồng độ của chất đệm, loại chất đệm điện giải cũng ảnh hƣởng đến sự điện di của chất tan. Tỏc động này thể hiện qua ổn định và duy trỡ dũng điện và cả dũng điện di thẩm thấu EOF trong mao quản. Qua đú sẽ làm ảnh hƣởng đến độ điện di hiệu lực μef của chất phõn tớch. Chất đệm điện giải CEC thể hiện qua cỏc yếu tố:
- Độ di chuyển của dũng EOF (àEOF). - Độ điện di của chất tan μef
- Dũng điện trong mao quản
- Sự hỡnh thành và di chuyển của Micell - Hệ số tỏch cỏc chất trong một hệ pha - Cuối cựng là sự tỏch của cỏc chất
Chất đệm pH và chất điện giải trọng CE là một trong những vấn đề cốt lừi của kỹ thuật sắc ký điện di mao quản. Nú đúng gúp một vai trũ quyết định trong kết quả điện di.
2.2. Dũng điện di thẩm thấu (EOF)
Cơ chế chớnh của sự di chuyển của cỏc phần tử chất tan (cỏc ion) trong ống mao quản là cơ chế di chuyển dƣới tỏc dụng của lực điện trƣờng E nhất định. Nhƣng bản chất chớnh của sự hoạt động trong ống mao quản của kỹ thuật tỏch CE là dũng chảy điện thẩm thấu (Electro Osmotic Flow: EOF). Dũng EOF cú quan hệ mật thiết với lớp điện tớch trờn thành ống mao quản và sẽ xỏc định thời gian tồn tại của chất tan (chất phõn tớch). Trong CEC, ngƣời ta thƣờng phõn cực mao quản sao cho dũng chảy hƣớng về catút (cực õm).
Dũng EOF đƣợc quyết định bởi thế V đặt vào hai đầu mao quản, pH của dung dịch đệm điện di và lớp điện kộp (thế Zờta), độ nhớt của dung dịch trong mao quản, hằng số điện mụi ε của pha động điện di, loại mao quản, độ xốp, cỡ hạt của chất nhồi trong mao quản (nếu mao quản cú nhồi pha tĩnh rắn xốp). Chớnh nhờ đặc tớnh này mà ngƣời ta cú thể chọn cỏc điều kiện hay cỏc yếu tố phự hợp nhất, để cú tốc độ dũng EOF phự hợp của quỏ trỡnh sắc ký một hỗn hợp chất.
Cỏc kết quả nghiờn cứu thực nghiệm cho thấy rằng, núi chung pH từ 4 đến 8, cỏc ống thuỷ tinh và thạch anh Silica thƣờng cú điện tớch õm, cũn polyme, teflon lại tớch điện dƣơng.
Khi bề mặt đó cú điện tớch, chỳng sẽ hấp thụ cỏc phần tử mang điện tớch trỏi dấu. Nhƣ vậy sẽ xuất hiện một lớp điện kộp, làm cho bề mặt cú một điện thế nhất định. Với cỏc bề mặt Silica ngƣời ta đó đo đƣợc thế bề mặt đú.
Mặc dầu trong mao quản cú dũng EOF, nhƣng bề mặt Silica (thành ống mao quản) vẫn bị kớch thớch bởi từ trƣờng điện E và nhƣ thế cỏc nhúm Silanol (-SiOH) trờn bề mặt cú thể bị dehydro hoỏ (bị tỏch H+ khỏi nhúm OH) làm cho bề mặt đú cú tớnh õm điện (vỡ lỳc này cú tồn tại gốc SiO- trờn thành ống). Tuy bề mặt (thành) ống mao quản cú tồn tại sự ion hoỏ này, nhƣng việc xỏc định chớnh xỏc giỏ trị pI (mức độ ion hoỏ) là rất khú khăn. Vỡ thế trong thực tế ngƣời ta khụng cần phải xỏc định giỏ trị pI này, mà chỉ cần giữ khụng đổi cỏc điều kiện đó chọn, để lớp điện kộp và thế Zờta là hằng định trong quỏ trỡnh sắc ký.
Do hiện tƣợng bề mặt mao quản cú điện tớch ma sỏt, bề mặt mao quản cú một lớp điện tớch trỏi dấu, nú là một lớp cỏc ion, đƣợc gọi là ion cửa, cỏc ion này hay cỏc ion đối trờn bề mặt (thành) ống mao quản, trong hầu hết cỏc trƣờng hợp là cation. Lớp cỏc ion đối này tạo ra một cực của lớp điện kộp trong thành ống mao quản Silica và cú một điện thế xỏc định trong những điều kiện xỏc định của hệ CEC. Điện thế này theo quan điểm của Hoỏ học, ngƣời ta gọi là thế Zờta.
Nghiờn cứu chi tiết về dũng EOF ngƣời ta thấy tốc độ di chuyển của dũng này tỷ lệ thuận với điện trƣờng E, với thế Zờta và hằng số lƣỡng cực điện, tỷ lệ nghịch với độ nhớt của dung dịch đệm trong mao quản theo biểu thức:
VEOF =E.(εζ/η) (25) Và tốc độ tuyến tớnh: uEOF = (E.εζ)/(4πη) (26) Cũn độ điện di của dũng EOF là:
μEOF =(εζ/η) (27)
Nhƣng vỡ cỏc ion nằm hoàn toàn trong EOF, do đú độ điện di tổng cộng (toàn phần) là:
μtot = (μe + μEOF) (28)
Trong đú:
VEOF: Tốc độ điện di của dũng EOF
UEOF: Tốc độ điện di tuyến tớnh của dũng EOF ΜEOF: Độ điện di của dũng EOF
ζ: Thế Zờta
η: Độ nhớt của dung dịch trong ống mao quản
ε: Hằng số lƣỡng cực điện của dung mụi (hằng số điện mụi)
Điện tớch bề mặt mao quản phụ thuộc nhiều vào giỏ trị pH của dung dịch,