[ARN] (µg/ml) = Giá trị đo ở 260nm x 40 x độ pha loãng
3.2.2.4 Quy trình PCR phát hiện MBV (Belcher ADN Young,1998) Khuếch đạ
Khuếch đại
Bảng 3.4: Thành phần hóa chất tham gia vào phản ứng khuếch đại của quy trình PCR phát hiện MBV
Điều kiện phản ứng
950C trong 5 phút 950C trong 30 giây
Sau đó 600C trong 1 phút Lặp lại chu kỳ 35 lần 720C trong 1 phút
720C trong 5 phút
Điện di: ( tương tự như ở mục 3.2.2.1)
Đọc kết quả: Mẫu hiện vạch ở vị trí 361 bp là mẫu dương tính với MBV. 3.2.2.5 Quy trình RT-PCR phát hiệnTSV ( Lê Phước Hiện, 2012)
Ly trích ARN với Trizol
- Cho 50-100 mg mẫu (5-10 tôm post) vào ống eppendorf 1,5ml có chứa 1000µl Trizol (lượng mẫu không vượt quá 10% trizol).
- Nghiền mẫu và giữ ở nhiệt độ phòng 5 phút.
Hóa chất/dung dịch Nồng độ Thể tích
Nước
Dung dịch đệm (5X) MgCl2 (25 mM) dNTPs (10 Mm)
Taq DNA polymerase (5 UI/ µl) Mồi MBV F (10 µM) Mồi MBV R (10 µM) ADN khuôn Tổng thể tích 1X 1.5 mM 0.2 mM 2.5 UI 0.4 µM 0.4 µM 400 ng 13,75 µl 5 µl 1.5 µl 0.5 µl 0.25 µl 1 µl 1 µl 2 µl 25 µl
- Ly tâm 12000 vòng trong 10 phút ở 40C để tạo phần viên. - Chuyển phần dịch trong sang một ống eppendorf 1,5ml mới.
- Thêm 200µl chloroform/1ml Trizol. Lắc cẩn thận bằng tay trong 15 giây. - Ủ ở 15-300 C trong 2-3 phút.
- Ly tâm 12000vòng/phút ở 40C trong 15 phút.
- Chuyển phần dịch trong phía trên sang một ống eppendorf 1,5 mới. - Thêm 500µl isopropanol/1ml Trizol. Ủ ở 15-300C trong 10 phút.
- Ly tâm 12000 vòng/phút trong 10 phút ở 40C, sau đó rút bỏ isopropanol. - Rửa phần viên bằng ethanol 75% (1ml ethanol 75%/ 1ml Trizol).
- Trộn đều bằng vortex và ly tâm 7500 vòng/phút ở 40C trong 5 phút. Cẩn thận rút bỏ hoàn toàn Ethanol.
- Làm khô phần viên trong 5-10 phút (air dry hoặc Vaccumn). Lưu ý không làm khô phần viên bằng máy ly tâm chân không – vacumn centrifuge). - Hòa tan phần viên với 40 µl TE buffer, trữ ở -800C.
Tạo cDNA ( Complementary DNA)
Sử dụng mồi Random Hexamers: Trộn hỗn hợp A:
Bảng 3.5: Thành phần hóa chất hỗn hợp A
Hóa chất/ dung dịch Thể tích
dNTP (10mM) 0,5µl
Mồi Random Hexamers ( 50ng/µl) 0,5µl
Mẫu RNA (200ng/µl) 5µl
Nước 0,5µl
Vortex nhẹ và hỗn hợp được ủ 650C trong 5 phút. Sau đó ủ hỗn hợp trên đá 5 phút . Sau đó ly tâm nhẹ hổn hợp.
Bảng 3.6: Thành phần hóa chất hỗn hợp B
Hóa chất/ dung dịch Thể tích
Dung dịch đệm 5X 2µl DTT 0,5µl SuperScript III Reverse transcriptase 0,5µl
Hỗn hợp B được ủ ở 420C trong 5 phút. Giữ ở nhiệt độ phòng khoảng 5 phút. Trộn hỗn hợp B vào hỗn hợp A: Điều kiện phản ứng: 250C trong 7 phút 550C trong 50 phút 700C trong 15 phút Giữ ở 250C
Khuếch đại cDNA
Bảng 3.7: Thành phần hóa chất phản ứng khuếch đại (qui trình phát hiện TSV của Navarro et al., 2009).
Hóa chất Nồng độ
Nước
Dung dịch đệm 1X
MgCl2 2,5mM
dNTPs 300µM
Taq DNA polymerase 2,5U
Mồi 7171F (10 µM) 0,62µM
Mồi 7511R (10 µM) 0,62µM
Điều kiện phản ứng:
600C trong 30 phút 950C trong 2 phút Sau đó: 950C trong 45 giây 600C trong 45 giây Lặp lại 35 chu kỳ Kết thúc: 600C trong 7 phút Giữ sản phẩm ở 160C trong 5 phút
Điện di
Quá trình điện di được thực hiện với dung dịch TAE 0,5X và bản thạch chứa 1,5% agarose
Chuẩn bị bản thạch (gel): đung nóng dung dịch agarose bằng lò vi sóng cho tới
khi agarose tan hoàn toàn. Sau đó để dung dịch nguội khoảng 50-60oC cho Ethium Bromide vào và đổ agarose vào khy đã chuẩn bị trước. Thể tích gel tùy thuộc vào kích cỡ của khay đựng gel khoảng 0,8cm.
Điện di: Dùng pipette hút 10µl cho mẫu cần phân tích trộn với một giọt 6X Loading Dye cho vào từng giếng một. Sử dụng thang AND để xác định khối lượng phân tử của sản phẩm PCR. Sau đó, nối bồn điện di với nguồn điện 90V (dòng điện từ 80-150V, không vượt quá 150V) để chạy gel trong 30-45 phút. Ngừng điện di khi màu xanh đậm di chuyển khoảng 1/2 đến 2/3 gel. Đặt gel lên bàn UV để đọc kết quả.
Phần 4