3.1 Vật liệu nghiên cứu
3.1.1 Địa điểm
Thu mẫu ở một số tỉnh ĐBSCL.
Phân tích mẫu tại Phòng thí nghiệm Bộ môn Sinh học & Bệnh thủy sản – Khoa Thủy Sản – Trường Đại Học Cần Thơ.
3.1.2 Dụng cụ Phân tích PCR Phân tích PCR
Máy ủ
Máy khuyếch đại gen (PCR) Tủ lạnh Tủ đông Bàn đoc UV Bộ điện di Cân điện tử Đầu eppendorf Ống eppendorf Pipet Que nghiền. 3.1.3 Hóa chất Lysis buffer Ethanol 75% TE buffer PCR buffer (10 mM Tris-HCl, pH 8,8, 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl2, 0,1% Trixton X-100)
MgCl2
dNTP mix (A,T, G, C)
Taq ADN polymerase (Fermentas) Primers
Agarose
Dung dịch TAE 0.5 X Ethidium bromide Loading Dye 6X
3.2 Phương pháp nghiên cứu 3.2.1 Phương pháp thu mẫu 3.2.1 Phương pháp thu mẫu
Tổng số lượng mẫu thu được là 43 mẫu tôm thẻ chân trắng gồm: 35 mẫu tôm giống và 8 mẫu tôm thịt ở các tỉnh Bạc Liêu, Cà Mau, Sóc Trăng.
Tại Bạc Liêu (19 mẫu), các mẫu thu được ký hiệu lần lượt là 05, 20, 35, 37, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 95, 120, BL6958. Tại Cà Mau (14 mẫu), các mẫu thu được ký hiệu lần lượt là D9D6972, ĐD7184, ĐD7086, ĐD7179, ĐD6980, ĐD6975, CM6887, CN7153, CM1, CM2, CM3, CM4, CM5, CM6. Tại Sóc Trăng (8 mẫu), các mẫu thu được ký hiệu lần lượt là ST1, ST2, ST3, ST4, ST5, ST6, ST7, ST8.
Mẫu thu cho phân tích PCR
Đối với tôm thương phẩm: thu từ 10-15 cá thể tôm/ao, mẫu được cắt lấy phần mang và cố định trong cồn 100%.
Đối với tôm giống: thu từ 30– 40 con/mẫu, mẫu tôm được cố định nguyên con hoặc cắt lấy phần đầu cố định trong cồn 100%.
3.2.2 Phương pháp PCR
3.2.2.1 Phương pháp đo hàm lượng ADN và ARN bằng máy so màu quang phổ phổ
Mẫu tôm sau khi ly trích được xác định hàm lượng ADN của mẫu bằng máy so màu quang phổ sử dụng bước sóng 260nm và 280nm. Sau đó tiến hành đo và đọc kết quả trên máy. Xác định hàm lượng ADN theo công thức sau
3.2.2.2 Quy trình PCR phát hiện IHHNV (Dương Kim Loan, 2009) Ly trích ADN (Lysis Buffer) Ly trích ADN (Lysis Buffer)
- Cắt mang tôm ( tôm thịt ) hoặc 15-20 tôm PL cho vào ống tuýp 1,5 ml. - Thêm 500 μl đệm ly trích DNA
- Nung nóng các tuýp ở 1000C trong 10 phút
- Để các tuýp nguội trong vài phút, ly tâm 13000 vòng/phút trong 5 phút. Chuyển 100 μl dung dịch nối chứa DNA sang tuýp có sẵn 200 μl cồn 100%.
- Cẩn thận đóng nắp tuýp và đảo tuýp nhẹ nhàng để trộn đều dung dịch, sau đó trộn nhanh với máy trộn mẫu (vortex)
- Ly tâm 13000 vòng/phút trong 10 phút để thu tủa ADN - Loaị bỏ dịch nối và để khô tự nhiên trong 30 phút. - Hòa tan tủa DNA bằng 200 μl dung dịch đệm TE.