chướng Dianthus ‘telstar purple picotee’
Để tạo mô sẹo trong nuôi cấy in-vitro, thường phải sử dụng các chất kích thích sinh trưởng thực vật bổ sung vào môi trường nuôi cấy, trong đó quan trọng nhất là auxin và cytokinin. Tỷ lệ auxin/cytokinin thích hợp kích thích tạo mô sẹo tùy thuộc vào từng đối tượng thực vật và nguồn gốc mẫu cấy. Ở cây đơn tử diệp, thường chỉ sử dụng auxin ở nồng độ cao để tạo mô sẹo, không cần thiết phải bổ sung cytokinin, còn ở cây song tử diệp, để tạo mô sẹo thường sử dụng auxin kết hợp với cytokinin ở tỷ lệ thích hợp (Machakova và cs, 2008).
Với đối tượng cây cẩm chướng Dianthus ‘telstar purple picotee’ là cây hai lá mầm, để tạo mô sẹo trong nuôi cấy in-vitro cần phải bổ sung vào môi trường nuôi cấy auxin và cytokinin ở tỷ lệ thích hợp.
• Tạo mô sẹo từ lá cây cẩm chướng in-vitro 2 tuần tuổi
Mẫu cấy lá nuôi trên các môi trường có nồng độ NAA 0,1mg/l kết hợp với BA ở các nồng độ khác nhau từ 0,5 mg/l đến 1,5 mg/l (môi trường B1, B2, B3) có sự hình thành mô sẹo nhưng kèm theo hình thành rễ (ảnh 3B1, 3B2, 3B3), khi tăng nồng độ BA lên 2mg/l ở môi trường MS½ + NAA 0,1 mg/l + BA 2 mg/l +15% ND (B4) thì mẫu cấy lá chỉ hình thành mô sẹo (ảnh 3B4). Từ kết quả thực nghiệm tạo mô sẹo từ lá cho thấy tỷ lệ auxin/cytokinin trong môi trường nuôi cấy ảnh hưởng đến sự phát sinh hình thái của mẫu cấy, điều này có thể do trong môi trường nuôi cấy có nồng độ NAA 0,1 mg/l không thay đổi trong khi BA thay đổi ở các nồng độ khác nhau, BA có nồng độ khác nhau sẽ được mẫu cấy hấp thu khác nhau và làm thay đổi hàm lượng cytokinin nội sinh trong mẫu cấy, dẫn đến làm mất cân bằng tỷ lệ auxin/cytokinin do đó làm cho hình thái của mẫu cấy thay đổi khác nhau giữa các môi trường, và sự thay đổi nồng độ BA từ 0,5 mg/l đến 1,5 mg/l có lẽ chưa đủ để ức chế sự hình thành rễ trong quá trình tạo mô sẹo của mẫu cấy nên mẫu cấy vừa tạo mô sẹo và vừa tạo rễ, khi tăng nồng độ BA lên 2 mg/l có lẽ đủ để ức chế sự hình thành rễ và đạt được sự cân bằng nội sinh cho sự hình thành mô sẹo, do vậy ở môi
trường MS½ + NAA 0,1 mg/l + BA 2 mg/l +15% ND (B4) chỉ hình thành mô sẹo mà không kèm theo hình thành rễ, đây có lẽ là môi trường có tỷ lệ auxin/cytokinin thích hợp cho sự hình thành mô sẹo đối với mẫu cấy lá.
Khi đo hoạt tính các chất điều hòa sinh trưởng thực vật nội sinh và cường độ hô hấp của mẫu cấy lá theo thời gian (bảng 3.11) nhận thấy hoạt tính của auxin trong mẫu lá ban đầu cao hơn nhiều so với cytokinin, có thể do vậy mẫu cấy lá hình thành mô sẹo và đồng thời dễ hình thành rễ kèm theo khi nồng độ cytokinin (BA) bổ sung vào môi trường nuôi cấy không đủ để ức chế hình thành rễ. Sau 1 tuần nuôi cấy lá trên môi trường B4, giải phẫu lá ở giai đoạn này thấy các tế bào nhu mô gia tăng kích thước mạnh (ảnh 11A), sự gia tăng kích thước tế bào nhu mô là do tác động chủ yếu của auxin; auxin tác động làm dãn vách tế bào đồng thời huy động nguyên liệu đến tế bào, do đó làm tăng áp suất thẫm thấu đồng thời cảm ứng các enzym tổng hợp vách làm tế bào tăng kích thước. Thật vậy, khi đo hoạt tính các chật điều hòa sinh trưởng thực vật nội sinh của mẫu cấy lá sau 1 tuần nuôi cấy thấy rằng hoạt tính của auxin tăng rất mạnh, và hoạt tính của cytokinin cũng tăng, sự gia tăng auxin và cytokinin nội sinh của mẫu cấy có thể do mẫu cấy hấp thu auxin và cytokinin ngoại sinh từ môi trường vào hoặc do sự tổng hợp nội sinh của mẫu cấy, làm thay đổi tỷ lệ nồng độ auxin/cytokinin nội sinh trong mẫu cấy, kích thích lá gia tăng kích thước và hình thành mô sẹo. Đến tuần thứ 2 và tuần thứ 3 tương ứng với giai đoạn mô sẹo đã hình thành và tăng sinh mạnh, hoạt tính của auxin giảm nhẹ trong khi hoạt tính của cytokinin tiếp tục tăng đến tuần thứ 3, điều này phù hợp vì sự tăng trưởng của mô sẹo chủ yếu do phân chia tế bào, do đó cytokinin tăng giúp kích thích sự phân chia tế bào với sự có mặt của auxin. Giberellin không thay đổi đáng kể trong sự hình thành mô sẹo, ABA giảm ở tuần đầu tiên sau nuôi cấy nhưng không thay đổi đáng kể ở các tuần tiếp theo, có lẽ giberelin và ABA không có vai trò quan trọng trong quá trình hình thành mô sẹo. Khi đo cường độ hô hấp trong quá trình tạo mô sẹo của mẫu cấy lá trên môi trường B4 thấy rằng cường độ hô hấp của mẫu cấy tăng dần theo thời gian, vì các tế bào đang phân chia mạnh cần năng lượng cao để tạo mới các chất, tạo thêm các bào quan (Taiz và Zeiger, 1991). Cường độ
hô hấp của tế bào đang phân hóa thấp hơn cường độ hô hấp của tế bào đang phân chia (Mai Trần Ngọc Tiếng, 2002)
Ở cùng môi trường giống nhau chỉ khác nồng độ NAA từ 0,1 mg/l tăng lên 0,2 mg/l (môi trường C1, C2, C3, C4) thì mẫu cấy hình thành nhiều rễ, điều đó cho thấy là auxin (NAA) tác động chính đến sự hình thành rễ, và sự hình thành rễ nhiều hay ít tùy thuộc vào sự tương tác giữa auxin (NAA) và cytokinin (BA) bổ sung vào môi trường nuôi cấy, vì cytokinin có vai trò kích thích sự phân chia tế bào, cản sự tạo rễ, trừ nồng độ yếu (kích thích sự tạo rễ gián tiếp qua vai trò kích thích sự phản phân hóa và phân chia tế bào) (Bùi Trang Việt, 2000). Do đó, ở các môi trường có nồng độ BA thấp từ 0,5 mg/l đến 1 mg/l hình thành mô sẹo và rễ hình thành rất nhiều (ảnh 3C1, 3C2), còn ở môi trường có nồng độ BA từ 1,5 mg/l đến 2 mg/l thì mẫu cấy lá gia tăng kích thước rất mạnh, ít hình thành mô sẹo và không hình thành rễ (ảnh 3C3, 3C4), có lẽ ở nồng độ NAA 0,2 mg/l kết hợp với BA 1,5 mg/l và BA 2 mg/l đủ để ức chế sự hình thành rễ nhưng không thích hợp cho sự hình thành mô sẹo.
Từ kết quả thí nghiệm đối với mẫu cấy lá cẩm chướng cho thấy, tỷ lệ kết hợp giữa nồng độ auxin (NAA) và nồng độ cytokinin (BA) ngoại sinh bổ sung vào môi trường nuôi cấy có ảnh hưởng khác nhau lên sự phát sinh hình thái của mẫu cấy.
• Tạo mô sẹo từ lá mầm cây cẩm chướng in-vitro 2 tuần tuổi
Mẫu cấy lá mầm nuôi cấy trên các môi trường giống như đối với mẫu cấy lá, nhưng sự thay đổi hình thái mẫu cấy lá mầm rất khác so với mẫu cấy lá, điều này cho thấy auxin (NAA) và cytokinin (BA) tác động lên các cơ quan khác nhau thì khác nhau (lá mầm (tử diệp) khác với lá).
Mẫu cấy lá mầm nuôi trên các môi trường có nồng độ NAA 0,2 mg/l kết hợp với BA ở các nồng độ khác nhau từ 0,5 mg/l đến 2 mg/l (ảnh 4C1, 4C2, 4C3, 4C4) hình thành mô sẹo và rễ nhiều hơn so với mẫu cấy lá. Sự hình thành mô sẹo và rễ ở lá mầm nhiều hơn ở lá có thể do lá chỉ chứa các chất hữu cơ từ quang hợp và hormon, còn lá mầm (tử diệp) có chứa các chất dự trữ và hormon đồng thời có khả năng quang hợp tổng hợp chất hữu cơ và các chất cần thiết cung cấp cho sự tăng
trưởng của tế bào, do đó khi gặp môi trường có tỷ lệ nồng độ auxin/cytokinin thích hợp đã hình thành mô sẹo và rễ nhiều hơn so với mẫu cấy lá.
Ở các môi trường có nồng độ NAA 0,1 mg/l kết hợp với BA ở các nồng độ khác nhau từ 0,5 mg/l đến 2 mg/l, hầu hết các mẫu cấy ít có khả năng tạo mô sẹo (ảnh 4B1, 4B2, 4B3, 4B4), có lẽ sự kết hợp giữa tỷ lệ auxin/cytokinin này không thích hợp đối với sự hình thành mô sẹo của mẫu cấy.
Trong các môi trường khảo sát sự tạo mô sẹo từ lá mầm, không chọn được môi trường nào thích hợp để tạo mô sẹo vì các môi trường tạo được mô sẹo nhưng cũng kèm theo hình thành rễ, có lẽ tỷ lệ auxin/cytokinin ở các môi trường này không thích hợp để chỉ hình mô sẹo.
• Tạo mô sẹo từ khúc cắt trụ hạ diệp cây cẩm chướng in-vitro 2 tuần tuổi
Khúc cắt trụ hạ diệp không tạo được mô sẹo và chuyển dần sang màu nâu sau 1 tuần nuôi cấy trên các môi trường khảo sát, điều này có thể do sự phối hợp tỷ lệ nồng độ auxin/cytokinin trong môi trường nuôi cấy không phù hợp để tạo mô sẹo hoặc do đặc tính sinh lý của mẫu cấy trụ hạ diệp khó tạo được mô sẹo vì trụ hạ diệp chỉ có vai trò vận chuyển, chứa ít chất dinh dưỡng, chất hữu cơ và hormon do đó khó tạo được mô sẹo vì sự tạo mô sẹo cần hormon, các chất hữu cơ cũng như các chất cần thiết khác giúp cho sự phản phân hóa và phân chia tế bào.
Qua kết quả thí nghiệm khảo sát sự hình thành mô sẹo từ các vật liệu khác nhau bao gồm: lá, lá mầm, trụ hạ diệp của cây mầm cẩm chướng in-vitro 2 tuần tuổi cho thấy sự tạo mô sẹo phụ thuộc vào sự kết hợp giữa auxin NAA và cytokinin BA trong môi trường nuôi cấy cũng như nguồn gốc của mẫu cấy, điều này phù hợp với quan điểm là ở cây song tử diệp, sự tạo mô sẹo cần có sự kết hợp giữa auxin và cytokinin trong môi trường nuôi cấy ở tỷ lệ thích hợp (Machakova và cs, 2008), và nguồn gốc mẫu cấy có khả năng quyết định sự tạo mô sẹo (Mahmood và cs, 2010), có lẽ do sự hiện diện của các chất điều hòa sinh trưởng thực vật nội sinh trong các loại mẫu cấy khác nhau có đáp ứng khác nhau đối với sự hình thành mô sẹo.