2.2.1. Khử trùng hột
Trong tủ cấy vô trùng, hột được khử trùng bằng cồn 70o trong 30 giây, sau đó khử trùng bằng Javel 15%, 20%, 25%, 30% trong 5 phút; rửa lại nước cất vô trùng 3 lần, đặt các hột trên môi trường MS½ + Vitamin (Morel và Westmore, 1951) + đường 20 mg/l + agar 7 g/l, pH 5,8.
2.2.2. Khảo sát sự tạo mô sẹo
Các mẫu cấy của cây cẩm chướng in-vitro 2 tuần tuổi bao gồm: Lá mầm (tử diệp), lá (lá thật) được cắt tạo vết thương, khúc cắt trụ hạ diệp dài 5 mm được đặt nằm ngang trên các môi trường tạo sẹo MS½ + 15% nước dừa có bổ sung NAA và BA ở các nồng độ khác nhau như sau:
Bảng 2.1. Các môi trường khảo sát ảnh hưởng của NAA và BA lên khả năng tạo mô sẹo của lá, lá mầm, khúc cắt trụ hạ diệp cây mầm cẩm chướng in-vitro 2 tuần tuổi.
STT Môi trường NAA (mg/l) BA (mg/l)
1 B1 0,1 0,5 2 B2 0,1 1 3 B3 0,1 1,5 4 B4 0,1 2 5 C1 0,2 0,5 6 C2 0,2 1 7 C3 0,2 1,5 8 C4 0,2 2
Theo dõi sự thay đổi của mẫu cấy theo thời gian. Từ đó chọn ra vật liệu và môi trường thích hợp nhất cho việc tạo mô sẹo.
2.2.3. Khảo sát sự tạo chồi 3.2.3.1. Tạo chồi từ mô sẹo 3.2.3.1. Tạo chồi từ mô sẹo
Mô sẹo 3 tuần tuổi từ lá được chuyển sang môi trường tái sinh chồi MS½ + 15% nước dừa và có bổ sung BA ở các nồng độ khác nhau như sau:
Bảng 2.2. Các môi trường khảo sát ảnh hưởng của BA lên khả năng tái sinh chồi từ mô sẹo lá 3 tuần tuổi. STT Môi trường BA (mg/l) 1 Đối chứng 0 2 A1 0,5 3 A2 1 4 A3 1,5 5 A4 2
Ghi nhận thời điểm chồi xuất hiện. Sau 4 tuần, đếm số chồi tạo ra ở mỗi môi trường.
3.2.3.2. Tạo chồi từ khúc cắt thân mang chồi ngủ
Khúc cắt thân mang chồi ngủ (khúc cắt thân loại bỏ tử diệp) 5 mm của cây mầm in-vitro 2 tuần tuổi được cấy vào môi trường tạo chồi MS½ + 15% nước dừa có bổ sung NAA và BA ở các nồng độ khác nhau như sau:
Bảng 2.3. Các môi trường khảo sát ảnh hưởng của NAA và BA lên khả năng tạo chồi từ khúc cắt thân mang chồi ngủ.
STT Môi trường NAA (mg/l) BA (mg/l)
1 Đối chứng 0 0 2 A1 0 0,5 3 A2 0 1 4 A3 0 1,5 5 A4 0 2 6 B1 0,1 0,5 7 B2 0,1 1 8 B3 0,1 1,5 9 B4 0,1 2 10 B5 0,1 2,5 11 C1 0,2 0,5 12 C2 0,2 1 13 C3 0,2 1,5 14 C4 0,2 2
Theo dõi sự tạo chồi theo thời gian. Sau 4 tuần, đếm số chồi được tạo ra, đo chiều dài chồi ở mỗi môi trường.
3.2.3.3. Tạo chồi từ khúc cắt thân mang chồi đỉnh
Khúc cắt thân mang chồi đỉnh 5 mm của cây mầm in-vitro 2 tuần tuổi được cấy vào môi trường tạo chồi MS½ + 15% nước dừa có bổ sung NAA và BA ở các nồng độ khác nhau như sau:
Bảng 2.4. Các môi trường khảo sát ảnh hưởng của NAA và BA lên khả năng tạo chồi từ khúc cắt thân mang chồi đỉnh.
STT Môi trường NAA (mg/l) BA (mg/l)
1 Đối chứng 0 0
2 B1 0,1 0,5
3 B2 0,1 1
4 B3 0,1 1,5
5 B4 0,1 2
2.2.4. Khảo sát sự tạo rễ 2.2.4.1. Tạo rễ từ mô sẹo 2.2.4.1. Tạo rễ từ mô sẹo
Các khối mô sẹo 3 tuần tuổi từ lá được chuyển sang môi trường tạo rễ MS½ và có bổ sung NAA ở các nồng độ khác nhau như sau:
Bảng 2.5. Các môi trường khảo sát ảnh hưởng của NAA lên khả năng tạo rễ từ mô sẹo lá 3 tuần tuổi.
STT Môi trường NAA (mg/l) (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
1 R0 0
2 R1 0,1
3 R2 0,2
4 R3 0,5
5 R4 1
Ghi nhận thời điểm rễ xuất hiện. Sau 2 tuần, đếm số rễ được tạo ra, đo chiều dài rễ.
2.2.4.2. Tạo rễ từ lá
Lá để nguyên của cây mầm in-vitro 2 tuần tuổi được đặt lên các môi trường có nồng độ NAA khác nhau từ 0-1 mg/l (R0, R1, R2, R3, R4) để khảo sát sự tạo rễ.
Ghi nhận thời điểm rễ xuất hiện. Sau 2 tuần, đếm số rễ được tạo ra, đo chiều dài rễ.
2.2.4.3. Tạo rễ từ chồi in-vitro
Các chồi in-vitro 4 tuần tuổi tăng trưởng tốt, nuôi cấy trên môi trường MS½ + NAA 0,1 mg/l + BA 1 mg/l +15% ND (B2) (thí nghiệm tạo chồi từ khúc cắt thân mang chồi đỉnh), được cắt ra có chiều cao 3 cm, mang 2 cặp lá và cấy vào các môi trường có nồng độ NAA khác nhau từ 0-1 mg/l (R0, R1, R2, R3, R4) để khảo sát sự ra rễ tạo cây con hoàn chỉnh.
Ghi nhận thời điểm rễ xuất hiện. Sau 2 tuần, đếm số rễ được tạo ra, đo chiều dài rễ.
2.2.5. Đưa cây ra vườn ươm
Các cây con trên môi trường tạo rễ từ chồi in-vitro tốt nhất được trồng trong vườn ươm. Các cây con sau khi lấy ra khỏi chai, rửa sạch agar và được ươm vào khay, sau 2 tuần chuyển sang chậu trồng với giá thể: Đất sạch + xơ dừa + tro trấu tỷ lệ 1:1:1 + phân bón lót (phân hữu cơ hoai). Điều kiện trồng trong vườn ươm: Nhiệt độ 27 – 30oC, ánh sáng tán xạ 50% , tưới phun sương ngày 2 lần.
Theo dõi sự sinh trưởng của cây cẩm chướng ngoài vườn ươm.
2.2.6. Quan sát hình thái giải phẫu
Dùng phương pháp giải phẫu cắt ngang, dọc mẫu, nhuộm 2 màu đỏ carmin và xanh iod để quan sát quá trình phát sinh mô sẹo từ lá, phát sinh hình thái chồi và rễ. Quan sát bằng kính hiển vi quang học.
Trong quá trình phát sinh mô sẹo từ lá: cắt ngang lá cây mầm in-vitro 2 tuần tuổi sau 0, 1, 2 tuần nuôi trên môi trường MS½ + NAA 0,1 mg/l + BA 2 mg/l +15% ND (B4).
Trong phát sinh hình thái chồi: cắt ngang, dọc mô sẹo 3 tuần tuổi sau 2, 5, 7 ngày chuyển sang môi trường MS½+ BA 1,5 mg/l +15% nước dừa (A3).
Trong phát sinh hình thái rễ: cắt ngang, dọc mô sẹo 3 tuần tuổi sau 2, 5, 7 ngày chuyển sang môi trường MS½+ NAA 0,2 mg/l (R2). Cắt ngang lá của cây mầm in-vitro 2 tuần tuổi sau 3, 5, 7 ngày nuôi cấy trên môi trường R2, và thân chồi
in-vitro sau 7 ngày nuôi cấy trên môi trường R2.
2.2.7. Đo cường độ hô hấp và hoạt tính các chất điều hòa sinh trưởng thực vật nội sinh thực vật nội sinh
Đo cường độ hô hấp và hoạt tính các chất điều hòa sinh trưởng thực vật nội sinh lá của cây mầm 2 tuần tuổi sau 0, 1, 2, 3 tuần nuôi cấy trên môi trường MS½ + NAA 0,1 mg/l + BA 2 mg/l +15% nước dừa (B4) và mô sẹo trên môi trường B4 sau 1 tuần chuyển sang môi trường tạo chồi MS½ + BA 1,5 mg/l +15% nước dừa (A3), và môi trường tạo rễ MS½ + NAA 0,2 mg/l +15% nước dừa (R2).
Đo cường độ hô hấp trong tối bằng máy đo sự trao đổi khí Leaflab 2 (Hanstech) với điện cực oxygen. Cường độ hô hấp được tính bằng µlO2 /g/giờ.
Đo hoạt tính các chất điều hòa sinh trưởng thực vật auxin, cytokinin, giberelin và acid abcisic bằng sinh trắc nghiệm (Mai Trần Ngọc Tiếng và csv 1980; Bùi Trang Việt, 1992) được tiến hành như sau:
Ly trích
Nghiền 1g mẫu, ngâm 24giờ với 50 ml metanol 80% trong tối, lọc thu lấy dịch lọc. Rửa bã và lọc thêm 2 lần, mỗi lần 20 ml metanol 80%. Cô cạn dịch lọc rồi thêm vào 5 ml nước cất.
Sắc ký
Dịch ete cô cạn còn khoàng 0,5 ml chứa chất trích được chấm lên bản sắc ký silicagel F254 (20 x 20 cm) cùng với các chất chuẩn Zeatin, IAA, ABA và GA3 .
Chạy sắc ký với dung môi di chuyển chloroform : metanol : acid acetic theo tỷ lệ 80 : 15 : 5 theo thể tích. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Xác định vị trí các chất điều hòa sinh trưởng thực vật bằng đèn UV. Dựa vào vị trí của chất chuẩn, tính Rf để suy ra vị trí của mẫu. Dùng dao lam cạo lấy các hạt silic ở vị trí mẫu, hòa thành dung dịch dùng cho sinh trắc nghiệm xác định hoạt tính.
Sinh trắc nghiệm
Hoạt tính các chất điều hòa sinh trưởng thực vật được đo dựa vào sinh trắc nghiệm.
Hoạt tính auxin và acid abcisic được đo bằng sinh trắc nghiệm khúc cắt diệp tiêu lúa (Oryza sativa L.) để 24 giờ trong tối. Sự sai biệt về chỉ số tăng trưởng diệp tiêu từ mẫu trích, mẫu chuẩn tinh khiết IAA 1 mg/l và ABA 1 mg/l, đối chứng (nước cất) xác định được hoạt tính tương đương IAA và ABA.
Hoạt tính cytokinin được đo bằng sinh trắc nghiệm dựa trên sự gia tăng trọng lượng tươi của tử diệp dưa leo (Cucumis sativus L.) để 48 giờ chiếu sáng liên tục với cường độ 3.000lux, 28 ± 2oC , độ ẩm 80%. Sự sai biệt trọng lượng tươi tử diệp dưa leo ở mẫu mẫu trích, mẫu chuẩn tinh khiết BA 1 mg/l, đối chứng (nước cất) xác định được hoạt tính tương đương của Zeatin nội sinh trong mẫu.
Hoạt tính của giberelin được đo bằng sinh trắc nghiệm trụ hạ diệp cây mầm xà lách (Lactuca sativa L.) để 72 giờ chiếu sáng liên tục với cường độ 3.000lux, 28
± 2oC, độ ẩm 80%. Sự sai biệt về chiều cao trụ hạ diệp của cây mầm ở mẫu mẫu trích, mẫu chuẩn tinh khiết GA310 mg/l, đối chứng (nước cất) sẽ xác định được hoạt tính tương đương của GA3 nội sinh trong mẫu.
Quá trình đo hoạt tính các chất điều hòa sinh trưởng thực vật nội sinh trong mẫu được thực hiện theo sơ đồ tóm tắt ở hình 2.
2.2.8. Xử lý thống kê
Các số liệu của kết quả thí nghiệm được xử lý bằng chương trình thống kê SPSS (Statistical Program Scientific System) dùng cho Window phiên bản 16.0. Sự khác biệt có ý nghĩa ở mức 95% của các giá trị được thể hiện bởi các chữ số cái khác nhau kèm theo.
Hình 2 : Sơđồ ly trích các chất điều hòa sinh trưởng thực vật Thêm 5 ml nước cất, chỉnh pH 2,5 Sinh trắc nghiệm auxin, ABA và GA Sinh trắc nghiệm cytokinin 3 ml NaHCO3 8% (3 lần) Chỉnh pH 7, thêm 10 ml Eter lắc 15 phút (3 lần) 3 ml NaHCO3 8% (3 lần) Quạt cạn Quạt cạn Dịch nước (lớp dưới) Dịch nước (lớp trên)
Nghiền 1g mẫu + 50 ml Metanol 80% ( Ngâm 24 giờ) Cô cạn dịch lọc còn khoảng 1ml Bình lóng, thêm 15 ml Eter, lắc 20 phút Dịch Eter Dịch Eter Dịch Eter Sắc ký Lắc, lọc dung dịch
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. KẾT QUẢ
3.1.1. Khử trùng hột
Các hột cây cẩm chướng được khử trùng bằng Javel trong 5 phút ở các nồng độ khác nhau. Sau 1 tuần ghi nhận kết quả trong bảng 3.1.
Bảng 3.1. Kết quả khử trùng hột với Javel ở các nồng độ khác nhau.
Nồng độ Javel (%) Tỷ lệ hột không nhiễm (%) Tỷ lệ hột nẩy mầm (%)
15 0 0 20 65 80
25 100 75
30 100 60
Tỷ lệ hột nẩy mầm cao và không nhiễm với thời gian khử trùng 5 phút ở nồng độ Javel 25%. Sau 1 ngày vỏ hột nứt ra, ngày thứ 2 hột bắt đầu chui ra khỏi vỏ. Sau 1 tuần cây mầm cao trung bình 1cm, sau 2 tuần cây mầm cao trung bình 4cm.
3.1.2. Khảo sát sự tạo mô sẹo 3.1.2.1. Tạo mô sẹo từ lá 3.1.2.1. Tạo mô sẹo từ lá
Khi theo dõi sự hình thành mô sẹo từ lá nuôi cấy trên các môi trường có nồng độ NAA và BA khác nhau, các biến đổi theo thời gian được ghi nhận ở bảng 3.2, và ảnh 3.
Bảng 3.2. Ảnh hưởng của BA và NAA lên sự thay đổi hình thái mẫu cấy lá cẩm chướng trên các môi trường tạo mô sẹo khác nhau theo thời gian nuôi cấy.
Môi trường
Tình trạng mẫu cấy
Tuần 1 Tuần 2 Tuần 3 Tuần 4
B1 Mẫu cấy gia tăng kích
thước (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Mô sẹo và rễ xuất hiện ít.
Mô sẹo ít, tăng sinh rất chậm.
Mô sẹo bắt đầu hóa nâu
B2 Mẫu cấy gia tăng kích
thước
Mô sẹo và rễ xuất hiện, nhiều
hơn B1.
Mô sẹo ít, tăng sinh chậm, xuất hiện nhiều rễ hơn.
Mô sẹo bắt đầu hóa nâu
B3 Mẫu cấy gia tăng kích
thước
Mô sẹo và rễ xuất hiện tương
tự B2.
Mô sẹo ít, tăng sinh chậm, rễ ít
hơn B2.
Mô sẹo bắt đầu hóa nâu
B4 Mẫu cấy gia tăng kích
thước
Mô sẹo xuất hiện nhiều, rễ
không xuất hiện.
Mô sẹo nhiều, tăng sinh mạnh.
Mô sẹo bắt đầu hóa nâu
C1 Mẫu cấy gia tăng kích
thước
Mô sẹo và rễ xuất hiện
Mô sẹo tăng sinh và rễ xuất hiện
nhiều hơn.
Mô sẹo bắt đầu hóa nâu
C2 Mẫu cấy gia tăng kích
thước (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Mô sẹo xuất hiện, và rễ rất
nhiều
Mô sẹo tăng sinh và rễ xuất hiện rất
nhiều.
Mô sẹo bắt đầu hóa nâu
C3 Mẫu cấy gia tăng kích
thước
Mô sẹo xuất hiện rất ít.
Mô sẹo tăng sinh rất ít.
Mô sẹo bắt đầu hóa nâu
C4 Mẫu cấy gia tăng kích
thước
Mô sẹo xuất hiện rất ít.
Mô sẹo tăng sinh rất ít, mẫu cấy bắt
đầu hóa nâu.
Mô sẹo bắt đầu hóa nâu
Ảnh 3: Sự thay đổi hình thái lá sau 3 tuần nuôi cấy trên các môi trường có nồng độ NAA và BA khác nhau MS½ + NAA 0,1 mg/l + BA 0,5 mg/l +15% ND (B1), MS½ + NAA 0,1 mg/l + BA 1 mg/l +15% ND (B2), MS½+ NAA 0,1 mg/l + BA 1,5 mg/l +15% ND (B3), MS½ + NAA 0,1 mg/l + BA 2 mg/l +15% ND (B4), MS½ + NAA 0,2 mg/l + BA 0,5 mg/l +15% ND (C1), MS½ + NAA 0,2 mg/l + BA 1 mg/l +15% ND (C2), MS½ + NAA 0,2 mg/l + BA 1,5 mg/l +15% ND (C3), MS½ + NAA 0,2 mg/l + BA 2 mg/l +15% ND (C4), C4 C3 C2 C1 B1 B2 B3 B4
Theo thời gian nuôi cấy, mẫu cấy gia tăng kích thước ở tuần đầu trong tất cả các môi trường, tuần thứ 2 mô sẹo bắt đầu hình thành đầu tiên ở chỗ vết cắt, tuần thứ 3 mô sẹo tiếp tục gia tăng kích thước nhưng đến tuần thứ 4 mô sẹo bắt đầu chuyển sang nâu ở các môi trường thí nghiệm.
Các môi trường có nồng độ NAA 0,1 mg/l kết hợp với BA có nồng độ từ 0,5 mg/l đến 1,5 mg/l (môi trường B1, B2, B3) mẫu cấy hình thành mô sẹo kèm theo hình thành rễ (ảnh 3B1, 3B2, 3B3), khi tăng nồng độ BA lên 2 mg/l (môi trường B4) mẫu cấy chỉ hình thành mô sẹo không hình thành rễ kèm theo như các môi trường khác, và môi trường MS½ + NAA 0,1 mg/l + BA 2 mg/l +15% ND (B4) thích hợp nhất để tạo mô sẹo từ lá (ảnh 3B4).
Ở các môi trường có nồng độ NAA tăng lên 0,2 mg/l kết hợp với BA 0,5 mg/l (môi trường C1) và BA 1 mg/l (môi trường C2) hình thành nhiều mô sẹo kèm theo hình thành rễ, đặc biệt môi trường MS½ + NAA 0,2 mg/l + BA 1 mg/l +15% ND (C2) hình thành rễ rất nhiều (ảnh 3C2), khi tăng nồng độ BA lên 1,5 mg/l đến 2 mg/l (môi trường C3, C4) không hình thành rễ nhưng mô sẹo tạo ra rất ít (ảnh 3C3, 3C4).
3.1.2.4. Tạo mô sẹo từ lá mầm
Khi theo dõi sự hình thành mô sẹo từ lá mầm nuôi cấy trên các môi trường có nồng độ NAA và BA khác nhau, các biến đổi theo thời gian được ghi nhận được nghi nhận ở bảng 3.3, và ảnh 4.
Bảng 3.3: Ảnh hưởng của BA và NAA lên sự thay đổi hình thái mẫu cấy lá mầm cẩm chướng trên các môi trường tạo mô sẹo khác nhau theo thời gian nuôi cấy.
Môi trường
Tình trạng mẫu cấy
Tuần 1 Tuần 2 Tuần 3
B1 Mẫu cấy gia tăng kích thước (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Mô sẹo và rễ xuất hiện ít, mẫu cấy bắt đầu hóa nâu.
Mô sẹo không tăng sinh, mẫu hóa nâu. B2 Mẫu cấy gia tăng
kích thước
Mô sẹo và rễ xuất hiện ít, mẫu cấy bắt đầu hóa nâu
tương tự B1
Mô sẹo không tăng sinh, mẫu hóa nâu.
B3 Mẫu cấy gia tăng kích thước
Mô sẹo xuất hiện ít, mẫu cấy bắt đầu hóa, nâu
không xuất hiện rễ.
Mô sẹo ít, không tăng sinh, mẫu hóa nâu.
B4 Mẫu cấy gia tăng kích thước chậm
Mô sẹo không xuất hiện, mẫu cấy bắt đầu hóa nâu
Mẫu hóa nâu.
C1 Mẫu cấy gia tăng kích thước
mạnh
Mô sẹo và rễ xuất hiện. Mô sẹo tăng sinh mạnh và rễ xuất hiện nhiều. C2 Mẫu cấy gia
tăng kích thước mạnh
Mô sẹo xuất hiện, và rễ rất nhiều
Mô sẹo tăng sinh và rễ xuất hiện rất nhiều.
C3 Mẫu cấy gia tăng kích thước mạnh
Mô sẹo và rễ xuất hiện ít. Mô sẹo tăng sinh rất ít.
C4 Mẫu cấy gia tăng