Dianthus ‘telstar purple picotee’
• Tạo chồi từ mô sẹo
Trong các môi trường khảo sát sự tạo chồi từ mô sẹo thì môi trường MS½ + BA 1,5 mg/l +15% ND (A3) có khả năng tái sinh chồi từ mô sẹo tốt nhất (bảng 3.4, ảnh 6). Khi đo hoạt tính các chất điều hòa sinh trưởng thực vật và cường độ hô hấp của mô sẹo trên môi trường tái sinh chồi A3 cho thấy hoạt tính của cytokinin tăng mạnh sau 1 tuần nuôi cấy trong khi hoạt tính của auxin, giberelin, ABA đều giảm, điều này cho thấy cytokinin có tác động chính trong sự tái sinh chồi từ mô sẹo ở nồng độ thích hợp, cường độ hô hấp cũng tăng mạnh để cung cấp năng lượng cho việc hình thành chồi.
Ở các môi trường không bổ sung BA hay có nồng độ BA thấp 0,5 mg/l không có khả năng tái sinh chồi có thể do nồng độ BA trong môi trường nuôi cấy thấp không đủ kích thích mô sẹo biệt hóa tạo chồi, vì vậy khi tăng nồng độ BA lên 1 mg/l đến 1,5 mg/l thì mô sẹo tạo được chồi và số chồi tăng khi tăng nồng độ BA trong môi trường nuôi cấy, nhưng nồng độ BA tăng lên 2 mg/l thì mô sẹo không tạo được chồi có thể do nồng độ BA 2 mg/l là quá cao gây độc cho tế bào làm cho mô sẹo không đi vào con đường biệt hóa tạo chồi.
• Tạo chồi từ khúc cắt thân mang chồi ngủ
Trong nuôi cấy in-vitro, để kích thích chồi nách phát triển và tạo thêm nhiều chồi mới, người ta thường bổ sung vào môi trường nuôi cấy cytokinin riêng rẽ hay kết hợp giữa auxin và cytokinin để kích thích gia tăng chồi nách, như ở cây Clitoria ternatea chồi nách khi nuôi cấy trên môi trường bổ sung 2 mg/l BA kết hợp với 0,25 mg/l NAA tạo được 5,21 chồi/mẫu sau 4 tuần nuôi cấy (Rout, 2004).
Đối với khúc cắt thân mang chồi ngủ cây cẩm chướng Dianthus ‘telstar purple picotee’ in-vitro 2 tuần tuổi nuôi trên các môi trường có bổ sung NAA và BA ở nồng độ khác nhau (bảng 3.6, ảnh 7) thấy rằng sự tạo chồi nhiều hay ít chủ yếu phụ thuộc vào nồng độ cytokinin (BA) ngoại sinh bổ sung vào môi trường nuôi cấy, khi tăng nồng độ BA lên thì số chồi tăng nhưng tăng quá cao thì số chồi giảm
xuống hoặc tạo rất nhiều chồi nhỏ không tăng trưởng được. Ngoài ra, sự tạo chồi còn tùy thuộc vào nồng độ auxin (NAA) ngoại sinh bổ sung vào môi trường nuôi cấy, ở nồng độ auxin thích hợp (NAA 0,1 mg/l) sẽ tương tác với cytokinin (BA) tạo sự cân bằng giữa phân chia và gia tăng kích thước tế bào tạo các chồi khỏe mạnh, còn ở nồng độ auxin cao (NAA 0,2 mg/l) sẽ kích thích hình thành mô sẹo và số chồi giảm. Trong các môi trường khảo sát sự tạo chồi từ khúc cắt thân mang chồi ngủ thì môi trường tạo được nhiều chồi nhất sau 4 tuần nuôi cấy là MS½+ BA 1 mg/l +15% ND (A2) tạo được 5,69 chồi/mẫu, môi trường MS½+ BA 1,5 mg/l +15% ND (A3) tạo được 5,89 chồi/mẫu và môi trường MS½+ NAA 0,1 mg/l + BA 1,5 mg/l +15% ND (B3) tạo được 5,52 chồi/mẫu (bảng 3.6, ảnh 7A2, 7A3, 7B3), có thể do nồng độ BA bổ sung vào môi trường nuôi cấy từ 1 mg/l đến 1,5 mg/l thích hợp để nhân chồi từ khúc cắt thân mang chồi ngủ cây cẩm chướng Dianthus ‘telstar purple picotee’, điều này phù hợp với kết quả tạo chồi từ khúc cắt thân mang chồi ngủ của một số giống cẩm chướng khác như D. caryophyllus tạo được 7,4 chồi/mẫu, D. chinensis tạo được 13,2 chồi/mẫu, D. barbatus tạo được 10,2 chồi/ mẫu khi nuôi cấy trên môi trường bổ sung NAA 0,5 mg/l kết hợp với BA 1 mg/l (Pareek và cs, 2004).
Trong thí nghiệm tạo chồi từ khúc cắt thân mang chồi ngủ thấy rằng ở các môi trường chỉ bổ sung BA ở các nồng độ khác nhau từ 0,5 mg/l đến 2 mg/l (môi trường A1, A2, A3, A4), các cụm chồi hình thành gặp hiện tượng thủy tinh thể và hiện tượng thủy tinh thể càng biểu hiện rõ khi càng tăng nồng độ BA lên trong môi trường nuôi cấy do BA càng nhiều sẽ hấp thu nước càng mạnh, điều này phù hợp với kết quả nghiên cứu về hiện tượng thủy tinh thể của cây cẩm chướng Dianthus caryophyllus, khi tăng nồng độ BA lên trong môi trường nuôi cấy thì số chồi tăng theo, chiều cao chồi giảm, đồng thời tỷ lệ chồi bị thủy tinh thể tăng theo (Kharrazi và cs, 2011). Thủy tinh thể là sự tạo nhiều nước không bình thường ảnh hưởng xấu đến chồi cây thân thảo cũng như cây thân gỗ trong nhân giống vô tính in-vitro. Khi bổ sung NAA 0,1 mg/l vào môi trường nuôi cấy có cùng nồng độ BA từ 0,5 mg/l đến 2 mg/l (môi trường B1, B2, B3, B4) thấy rằng hiện tượng thủy tinh thể giảm, có
thể do mẫu cấy hấp thu auxin vào làm thay đổi tỷ lệ nồng độ auxin/cytokinin nội sinh đã cảm ứng các enzym hoạt động đồng thời lôi kéo các chất dinh dưỡng cần thiết tạo sự cân bằng trong tăng trưởng do đó làm giảm hiện tượng thủy tinh thể.
Khi tăng nồng độ NAA lên 0,2 mg/l kết hợp với BA ở các nồng độ khác nhau từ 0,5 mg/l đến 2 mg/l (môi trường C1, C2, C3, C4) thì mô sẹo hình thành rất nhiều ở dưới gốc cụm chồi và số chồi tạo ra giảm so với các môi trường không có NAA (môi trường A1, A2, A3) và các môi trường có bổ sung NAA 0,1 mg/l (môi trường B1, B2, B3, B4), điều này cho thấy auxin (NAA) có tác động đến sự hình thành mô sẹo, và có lẽ nồng độ NAA 0,2 mg/l là cao đối với khúc cắt thân mang chồi ngủ nên đã kích thích hình thành mô sẹo vì ở nồng độ cao auxin kích thích sự tạo mô sẹo (Bùi Trang Việt, 1998).
Qua thí nghiệm tạo chồi từ khúc cắt thân mang chồi ngủ cho thấy tỷ lệ nồng độ auxin/cytokinin ngoại sinh bổ sung vào môi trường nuôi cấy sẽ quyết định chiều hướng phát sinh hình thái của mẫu cấy.
• Tạo chồi từ khúc cắt thân mang chồi đỉnh
Các chồi đỉnh của cây mầm cẩm chướng in-vitro 2 tuần tuổi được nuôi cấy trên môi trường có bổ sung NAA 0,1 mg/l kết hợp với BA có nồng độ từ 0,5 mg/l đến 2 mg/l (môi trường B1, B2, B3, B4) (bảng 3.7, ảnh 8). Sau 4 tuần nuôi cấy thấy rằng khi tăng nồng độ BA lên thì số chồi tăng, chiều cao giảm, và môi trường MS½ + NAA 0,1 mg/l + BA 1,5 mg/l +15% ND (B3) tạo ra nhiều chồi nhất (25,26 chồi) nhưng chồi ngắn và lá nhỏ, nếu tăng nồng độ BA lên 2 mg/l thì số chồi giảm xuống, điều này phù hợp với các báo cáo trước đây đối với một số giống cẩm chướng, nhưng ở các giống khác nhau thì nồng độ auxin và cytokinin tối ưu cho sự tạo chồi khác nhau.
Qua các thí nghiệm khảo sát sự tạo chồi từ mô sẹo, tạo chồi từ khúc cắt thân mang chồi ngủ, tạo chồi từ khúc cắt thân mang chồi đỉnh thấy rằng vật liệu khúc cắt thân mang chồi đỉnh nuôi cấy trên môi trường MS½ + NAA 0,1 mg/l + BA 1 mg/l +15% ND (B2) thích hợp nhất để nhân chồi vì số chồi tạo ra nhiều (11,36 chồi/mẫu) và tăng trưởng tốt.
Nhìn chung, khi môi trường nuôi cấy có bổ sung cytokinin sẽ đưa đến kết quả là tạo thành các cụm chồi, số lượng chồi hình thành tùy thuộc vào nồng độ cytokinin. Tuy nhiên cũng có những bất lợi nhất định trong việc điều chỉnh nồng độ để cảm ứng tạo nhiều chồi là chồi được tạo ra trở lên nhỏ, không thể kéo dài đến một kích thước nhất định để có thể được tách ra cho sự hình thành rễ, và tạo ra những lá bất thường.