Các số liệu của kết quả thí nghiệm được xử lý bằng chương trình thống kê SPSS (Statistical Program Scientific System) dùng cho Window phiên bản 16.0. Sự khác biệt có ý nghĩa ở mức 95% của các giá trị được thể hiện bởi các chữ số cái khác nhau kèm theo.
Hình 2 : Sơđồ ly trích các chất điều hòa sinh trưởng thực vật Thêm 5 ml nước cất, chỉnh pH 2,5 Sinh trắc nghiệm auxin, ABA và GA Sinh trắc nghiệm cytokinin 3 ml NaHCO3 8% (3 lần) Chỉnh pH 7, thêm 10 ml Eter lắc 15 phút (3 lần) 3 ml NaHCO3 8% (3 lần) Quạt cạn Quạt cạn Dịch nước (lớp dưới) Dịch nước (lớp trên)
Nghiền 1g mẫu + 50 ml Metanol 80% ( Ngâm 24 giờ) Cô cạn dịch lọc còn khoảng 1ml Bình lóng, thêm 15 ml Eter, lắc 20 phút Dịch Eter Dịch Eter Dịch Eter Sắc ký Lắc, lọc dung dịch
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. KẾT QUẢ
3.1.1. Khử trùng hột
Các hột cây cẩm chướng được khử trùng bằng Javel trong 5 phút ở các nồng độ khác nhau. Sau 1 tuần ghi nhận kết quả trong bảng 3.1.
Bảng 3.1. Kết quả khử trùng hột với Javel ở các nồng độ khác nhau.
Nồng độ Javel (%) Tỷ lệ hột không nhiễm (%) Tỷ lệ hột nẩy mầm (%)
15 0 0 20 65 80
25 100 75
30 100 60
Tỷ lệ hột nẩy mầm cao và không nhiễm với thời gian khử trùng 5 phút ở nồng độ Javel 25%. Sau 1 ngày vỏ hột nứt ra, ngày thứ 2 hột bắt đầu chui ra khỏi vỏ. Sau 1 tuần cây mầm cao trung bình 1cm, sau 2 tuần cây mầm cao trung bình 4cm.
3.1.2. Khảo sát sự tạo mô sẹo 3.1.2.1. Tạo mô sẹo từ lá 3.1.2.1. Tạo mô sẹo từ lá
Khi theo dõi sự hình thành mô sẹo từ lá nuôi cấy trên các môi trường có nồng độ NAA và BA khác nhau, các biến đổi theo thời gian được ghi nhận ở bảng 3.2, và ảnh 3.
Bảng 3.2. Ảnh hưởng của BA và NAA lên sự thay đổi hình thái mẫu cấy lá cẩm chướng trên các môi trường tạo mô sẹo khác nhau theo thời gian nuôi cấy.
Môi trường
Tình trạng mẫu cấy
Tuần 1 Tuần 2 Tuần 3 Tuần 4
B1 Mẫu cấy gia tăng kích
thước
Mô sẹo và rễ xuất hiện ít.
Mô sẹo ít, tăng sinh rất chậm.
Mô sẹo bắt đầu hóa nâu
B2 Mẫu cấy gia tăng kích
thước
Mô sẹo và rễ xuất hiện, nhiều
hơn B1.
Mô sẹo ít, tăng sinh chậm, xuất hiện nhiều rễ hơn.
Mô sẹo bắt đầu hóa nâu
B3 Mẫu cấy gia tăng kích (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
thước
Mô sẹo và rễ xuất hiện tương
tự B2.
Mô sẹo ít, tăng sinh chậm, rễ ít
hơn B2.
Mô sẹo bắt đầu hóa nâu
B4 Mẫu cấy gia tăng kích
thước
Mô sẹo xuất hiện nhiều, rễ
không xuất hiện.
Mô sẹo nhiều, tăng sinh mạnh.
Mô sẹo bắt đầu hóa nâu
C1 Mẫu cấy gia tăng kích
thước
Mô sẹo và rễ xuất hiện
Mô sẹo tăng sinh và rễ xuất hiện
nhiều hơn.
Mô sẹo bắt đầu hóa nâu
C2 Mẫu cấy gia tăng kích
thước
Mô sẹo xuất hiện, và rễ rất
nhiều
Mô sẹo tăng sinh và rễ xuất hiện rất
nhiều.
Mô sẹo bắt đầu hóa nâu
C3 Mẫu cấy gia tăng kích
thước
Mô sẹo xuất hiện rất ít.
Mô sẹo tăng sinh rất ít.
Mô sẹo bắt đầu hóa nâu (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
C4 Mẫu cấy gia tăng kích
thước
Mô sẹo xuất hiện rất ít.
Mô sẹo tăng sinh rất ít, mẫu cấy bắt
đầu hóa nâu.
Mô sẹo bắt đầu hóa nâu
Ảnh 3: Sự thay đổi hình thái lá sau 3 tuần nuôi cấy trên các môi trường có nồng độ NAA và BA khác nhau MS½ + NAA 0,1 mg/l + BA 0,5 mg/l +15% ND (B1), MS½ + NAA 0,1 mg/l + BA 1 mg/l +15% ND (B2), MS½+ NAA 0,1 mg/l + BA 1,5 mg/l +15% ND (B3), MS½ + NAA 0,1 mg/l + BA 2 mg/l +15% ND (B4), MS½ + NAA 0,2 mg/l + BA 0,5 mg/l +15% ND (C1), MS½ + NAA 0,2 mg/l + BA 1 mg/l +15% ND (C2), MS½ + NAA 0,2 mg/l + BA 1,5 mg/l +15% ND (C3), MS½ + NAA 0,2 mg/l + BA 2 mg/l +15% ND (C4), C4 C3 C2 C1 B1 B2 B3 B4
Theo thời gian nuôi cấy, mẫu cấy gia tăng kích thước ở tuần đầu trong tất cả các môi trường, tuần thứ 2 mô sẹo bắt đầu hình thành đầu tiên ở chỗ vết cắt, tuần thứ 3 mô sẹo tiếp tục gia tăng kích thước nhưng đến tuần thứ 4 mô sẹo bắt đầu chuyển sang nâu ở các môi trường thí nghiệm.
Các môi trường có nồng độ NAA 0,1 mg/l kết hợp với BA có nồng độ từ 0,5 mg/l đến 1,5 mg/l (môi trường B1, B2, B3) mẫu cấy hình thành mô sẹo kèm theo hình thành rễ (ảnh 3B1, 3B2, 3B3), khi tăng nồng độ BA lên 2 mg/l (môi trường B4) mẫu cấy chỉ hình thành mô sẹo không hình thành rễ kèm theo như các môi trường khác, và môi trường MS½ + NAA 0,1 mg/l + BA 2 mg/l +15% ND (B4) thích hợp nhất để tạo mô sẹo từ lá (ảnh 3B4).
Ở các môi trường có nồng độ NAA tăng lên 0,2 mg/l kết hợp với BA 0,5 mg/l (môi trường C1) và BA 1 mg/l (môi trường C2) hình thành nhiều mô sẹo kèm theo hình thành rễ, đặc biệt môi trường MS½ + NAA 0,2 mg/l + BA 1 mg/l +15% ND (C2) hình thành rễ rất nhiều (ảnh 3C2), khi tăng nồng độ BA lên 1,5 mg/l đến 2 mg/l (môi trường C3, C4) không hình thành rễ nhưng mô sẹo tạo ra rất ít (ảnh 3C3, 3C4).
3.1.2.4. Tạo mô sẹo từ lá mầm
Khi theo dõi sự hình thành mô sẹo từ lá mầm nuôi cấy trên các môi trường có nồng độ NAA và BA khác nhau, các biến đổi theo thời gian được ghi nhận được nghi nhận ở bảng 3.3, và ảnh 4.
Bảng 3.3: Ảnh hưởng của BA và NAA lên sự thay đổi hình thái mẫu cấy lá mầm cẩm chướng trên các môi trường tạo mô sẹo khác nhau theo thời gian nuôi cấy.
Môi trường
Tình trạng mẫu cấy
Tuần 1 Tuần 2 Tuần 3
B1 Mẫu cấy gia tăng kích thước
Mô sẹo và rễ xuất hiện ít, mẫu cấy bắt đầu hóa nâu.
Mô sẹo không tăng sinh, mẫu hóa nâu. B2 Mẫu cấy gia tăng
kích thước
Mô sẹo và rễ xuất hiện ít, mẫu cấy bắt đầu hóa nâu
tương tự B1
Mô sẹo không tăng sinh, mẫu hóa nâu.
B3 Mẫu cấy gia tăng kích thước
Mô sẹo xuất hiện ít, mẫu cấy bắt đầu hóa, nâu
không xuất hiện rễ.
Mô sẹo ít, không tăng sinh, mẫu hóa nâu. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
B4 Mẫu cấy gia tăng kích thước chậm
Mô sẹo không xuất hiện, mẫu cấy bắt đầu hóa nâu
Mẫu hóa nâu.
C1 Mẫu cấy gia tăng kích thước
mạnh
Mô sẹo và rễ xuất hiện. Mô sẹo tăng sinh mạnh và rễ xuất hiện nhiều. C2 Mẫu cấy gia
tăng kích thước mạnh
Mô sẹo xuất hiện, và rễ rất nhiều
Mô sẹo tăng sinh và rễ xuất hiện rất nhiều.
C3 Mẫu cấy gia tăng kích thước mạnh
Mô sẹo và rễ xuất hiện ít. Mô sẹo tăng sinh rất ít.
C4 Mẫu cấy gia tăng kích thước mạnh
Mô sẹo và rễ xuất hiện ít. Mô sẹo tăng sinh rất ít, mẫu cấy hóa nâu.
Ảnh 4: Sự thay đổi hình thái lá mầm sau 3 tuần nuôi cấy trên các môi trường có nồng độ
NAA và BA khác nhau. MS½ + NAA 0,1 mg/l + BA 0,5 mg/l +15% ND (B1), MS½ + NAA 0,1 mg/l + BA 1 mg/l +15% ND (B2), MS½+ NAA 0,1 mg/l + BA 1,5 mg/l +15% ND (B3), MS½ + NAA 0,1 mg/l + BA 2 mg/l +15% ND (B4), MS½ + NAA 0,2 mg/l + BA 0,5 mg/l +15% ND (C1), MS½ + NAA 0,2 mg/l + BA 1 mg/l +15% ND (C2), MS½ + NAA 0,2 mg/l + BA 1,5 mg/l +15% ND (C3), MS½ + NAA 0,2 mg/l + BA 2 mg/l +15% ND (C4), C3 C4 B3 B4 B1 B2 C2 C1
Theo thời gian nuôi cấy, mẫu cấy gia tăng kích thước ở tuần đầu trong tất cả các môi trường. Ở tuần thứ 2, các môi trường có nồng độ NAA 0,1 mg/l kết hợp với BA có nồng độ từ 0,5 mg/l đến 1,5 mg/l (môi trường B1, B2, B3) mô sẹo hình thành rất ít kèm theo hình thành rễ và mẫu cấy bắt đầu hóa nâu, khi tăng nồng độ BA lên 2mg/l (môi trường B4) mẫu cấy không hình thành mô sẹo và bắt đầu hóa nâu. Đến tuần thứ 3, trên các môi trường có nồng độ NAA 0,1 mg/l kết hợp với BA có nồng độ từ 0,5 mg/l đến 2 mg/l hầu hết các mẫu cấy hóa nâu (ảnh 4B1, 4B2, 4B3, 4B4)
Ở các môi trường có nồng độ NAA tăng lên 0,2 mg/l kết hợp với BA 0,5 mg/l (môi trường C1) và BA 1 mg/l (môi trường C2) hình thành nhiều mô sẹo kèm theo hình thành rễ, đặc biệt môi trường MS½ + NAA 0,2 mg/l + BA 1 mg/l +15% ND (C2) hình thành rễ rất nhiều (ảnh 4C2), khi tăng nồng độ BA lên 1,5 mg/l đến 2 mg/l (môi trường C3, C4) mẫu cấy gia tăng kích thước mạnh nhưng mô sẹo tạo ra ít và có hình thành rễ ít (ảnh 4C3, 4C4).
3.1.2.5. Tạo mô sẹo từ khúc cắt trụ hạ diệp
Đối với khúc cắt trụ hạ diệp cây mầm cẩm chướng in-vitro 2 tuần tuổi nuôi cấy trên các môi trường có nồng độ NAA 0,1 mg/l kết hợp với BA có nồng độ từ 0,5 mg/l đến 2 mg/l (môi trường B1, B2, B3, B4), và các môi trường có nồng độ NAA 0,2 mg/l kết hợp với BA có nồng độ từ 0,5 mg/l đến 2 mg/l (môi trường C1, C2, C3, C4). Kết quả sau 3 tuần, các mẫu cấy không hình thành mô sẹo (ảnh 5), tuần đầu các mẫu cấy còn màu xanh lục nhạt, ở tuần thứ 2 chuyển dần sang nâu, đến tuần thứ 3 các mẫu cấy hóa nâu.
Ảnh 5: Khúc cắt trụ hạ diệp sau 3 tuần nuôi cấy trên môi trường MS½ + NAA 0,1 mg/l + BA 1 mg/l +15% ND (B2).
Qua các kết quả thí nghiệm khảo sát sự tạo mô sẹo trên các vật liệu lá, lá mầm, khúc cắt trụ hạ diệp cho thấy vật liệu lá nuôi trên môi trường MS½ + NAA 0,1 mg/l + BA 2 mg/l +15% ND (B4) thích hợp nhất cho sự tạo mô sẹo, và mô sẹo 3 tuần tuổi từ môi trường này được sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo.
3.1.3. Khảo sát sự tạo chồi 3.1.3.1. Tạo chồi từ mô sẹo lá 3.1.3.1. Tạo chồi từ mô sẹo lá
Sự tạo chồi từ mô sẹo lá trên các môi trường có nồng độ BA khác nhau được nghi nhận ở bảng 3.4, và ảnh 6.
Bảng 3.4: Ảnh hưởng của BA lên khả năng tái sinh chồi từ mô sẹo lá 3 tuần tuổi trên các môi trường khác nhau sau 4 tuần nuôi cấy.
Môi trường Thời gian xuất hiện chồi
(tuần) Tỷ lệ tạo chồi (Sau 4 tuần) (%) Số chồi/mẫu (Sau 4 tuần) (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Chiều dài chồi (cm) (Sau 4 tuần) Đối chứng 0 0 0 0 A1 0 0 0 0 A2 1 26,67 ± 4,41a 6,83 ± 7,26a 2,25 ± 0,21b A3 1 40,67± 2,33b 12,07 ± 1,39b 1,53 ± 0,14a A4 0 0 0 0
Trong các môi trường khảo sát chỉ có môi trường MS½ + BA 1 mg/l +15% ND (A2) và môi trường MS½ + BA 1,5 mg/l +15% ND (A3) có khả năng tái sinh chồi từ mô sẹo lá (ảnh 6), sau 1 tuần chồi bắt đầu xuất hiện và tăng nhanh số lượng cũng như kích thước trong các tuần tiếp theo. Giữa hai môi trường có khả năng tạo chồi MS½ + BA 1 mg/l +15% ND (A2) và MS½ + BA 1,5 mg/l +15% ND (A3) thì môi trường A3 có số chồi được tạo ra nhiều nhất sau 4 tuần nuôi cấy. Các môi trường đối chứng MS½ +15% ND, môi trường MS½ + BA 0,5 mg/l +15% ND (A1), môi trường MS½ + BA 2 mg/l +15% ND (A4) không tạo được chồi, mô sẹo chuyển sang màu nâu sau 4 tuần nuôi cấy.
Ảnh 6: Tái sinh chồi từ mô sẹo lá sau 1 tuần (A), sau 2 tuần (B), sau 4 tuần (C) nuôi cấy trên môi trường MS½ + BA 1,5 mg/l +15% ND (A3).
A B
C
1cm
1cm 1cm
3.1.3.2. Tạo chồi từ khúc cắt thân mang chồi ngủ
Khi theo dõi sự tạo chồi từ khúc cắt thân mang chồi ngủ trên các môi trường có nồng độ NAA và BA khác nhau, các biến đổi của mẫu cấy theo thời gian được nghi nhận ở bảng 3.5 và hình 7.
Bảng 3.5: Ảnh hưởng của BA và NAA lên sự thay đổi hình thái khúc cắt thân mang chồi ngủ theo thời gian nuôi cấy.
Môi trường
Tuần1 Tuần 2 Tuần 4
Đối chứng
Hai chồi ngủ ở kẽ lá mọc cao lên nhanh
Hai chồi ngủ tiếp tục mọc cao lên
Một số mẫu tạo thêm chồi mới A1 Hai chồi ngủ ở kẽ lá
mọc cao lên nhanh Tạo thêm chồi mới
Tạo thêm nhiều chồi mới, thân và lá chồi dày,
to chứa nước A2 Hai chồi ngủ ở kẽ lá
mọc cao lên nhanh Tạo thêm chồi mới
Tạo thêm nhiều chồi mới, thân và lá chồi dày,
to chứa nước A3 Hai chồi ngủ ở kẽ lá
mọc cao lên nhanh Tạo thêm chồi mới
Tạo thêm nhiều chồi mới, thân và lá chồi dày,
to chứa nước
A4 Một số chồi ngủ ở kẽ lá mọc nhưng chậm
Không tạo chồi mới, hình dạng lá thay đổi bất thường, lá dày, to, màu trắng
Không tạo chồi mới, chồi tăng trưởng chậm, (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
thân, lá dày, to màu trắng
B1 Hai chồi ngủ ở kẽ lá
mọc cao lên nhanh Tạo thêm chồi mới, ở gốc tạo một ít mô sẹo
Tạo thêm nhiều chồi mới, mô sẹo ở gốc cụm
chồi tăng chậm B2 Hai chồi ngủ ở kẽ lá
mọc cao lên nhanh Tạo thêm chồi mới
Tạo thêm nhiều chồi mới, gốc cụm chồi phù
to ra, có một ít mô sẹo B3 Hai chồi ngủ ở kẽ lá
mọc cao lên nhanh Tạo thêm chồi mới
Tạo thêm nhiều chồi mới
B4 Hai chồi ngủ ở kẽ lá
mọc chậm Chưa tạo chồi mới
Tạo thêm ít chồi mới, thân và lá chồi dày, to
chứa nước.
B5 Hình dạng mẫu cấy thay đổi
Mẫu cấy phát triển bất thường, tạo rất chồi nhỏ không phát
triển được
Mẫu cấy tạo rất nhiều chồi nhỏ không phát
triển được làm tăng kích thước cụm chồi
C1 Hai chồi ngủ ở kẽ lá mọc cao lên đồng thời
hình thành mô sẹo ở gốc
Chưa tạo chồi mới, mô sẹo ở gốc tăng
nhanh
Tạo thêm chồi mới Mô sẹo ở gốc bắt đẩu chuyển sang màu nâu
C2 Hai chồi ngủ ở kẽ lá mọc cao lên đồng thời
hình thành mô sẹo ở gốc
Chưa tạo chồi mới, mô sẹo ở gốc tăng
nhanh
Tạo thêm chồi mới. Mô sẹo ở gốc bắt đầu chuyển
sang màu nâu (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
C3 Hai chồi ngủ ở kẽ lá mọc cao lên đồng thời
hình thành mô sẹo ở gốc
Chưa tạo chồi mới, mô sẹo ở gốc tăng
nhanh
Không tạo chồi mới, thân và lá to chứa nước. Mô sẹo ở gốc đang tăng
sinh, có màu xanh
C4 Hai chồi ngủ ở kẽ lá mọc cao lên đồng thời
hình thành mô sẹo ở gốc
Chưa tạo chồi mới, mô sẹo ở gốc tăng
nhanh
Không tạo chồi mới, thân và lá to chứa nước. Mô sẹo ở gốc đang tăng
Ảnh 7: Sự hình thành chồi từ khúc cắt thân mang chồi ngủ sau 4 tuần nuôi cấy trên các môi trường có nồng độ NAA và BA khác nhau
ĐC A1 A2 A3 A4 B1 B2 B3 B4 C1 C2 C3 B5 C4
MS½ +15% ND (ĐC) MS½ + BA 0,5 mg/l +15% ND (A1), MS½ + BA 1 mg/l +15% ND (A2), MS½ + BA 1,5 mg/l +15% ND (A3), MS½ + BA 2 mg/l +15% ND (A4), MS½ + NAA 0,1 mg/l + BA 0,5 mg/l +15% ND (B1), MS½ + NAA 0,1 mg/l + BA 1 mg/l +15% ND (B2), MS½+ NAA 0,1 mg/l + BA 1,5 mg/l +15% ND (B3), MS½ + NAA 0,1 mg/l + BA 2 mg/l +15% ND (B4), MS½ + NAA 0,1mg/l + BA 2,5mg/l +15% ND (B5), MS½ + NAA 0,2 mg/l + BA 0,5 mg/l +15% ND (C1), MS½ + NAA 0,2 mg/l + BA 1 mg/l +15% ND (C2), MS½ + NAA 0,2 mg/l + BA 1,5 mg/l +15% ND (C3), MS½ + NAA 0,2 mg/l + BA 2 mg/l +15% ND (C4),
Ở các môi trường nuôi cấy khúc cắt thân mang chồi ngủ chỉ có BA ở các nồng độ khác nhau từ 0,5 mg/l đến 1,5 mg/l không có NAA (môi trường A1, A2, A3, A4) mẫu cấy tạo được cụm chồi mà không có sự xuất hiện mô sẹo ở gốc nơi tiếp xúc với môi trường nhưng chồi có biểu hiện của hiện tượng thủy tinh thể (ảnh 7A1, 7A2, 7A3). Riêng ở môi trường MS½ + BA 2 mg/l +15% ND (A4) mẫu cấy không tạo được cụm chồi và chồi phát triển chậm (ảnh 7A4), ở môi trường này gặp hiện tượng thủy tinh thể rất rõ. Khi môi trường được bổ sung thêm NAA 0,1 mg/l kết hợp với BA ở nồng độ thấp 0,5 mg/l và 1 mg/l (môi trường B1, B2) thì mẫu cấy tạo được cụm chồi đồng thời có hình thành ít mô sẹo kèm theo (ảnh 7B1, 7B2), còn ở nồng độ BA cao 1,5 mg/l đến 2,5 mg/l (môi trường B3, B4, B5) thì chỉ hình thành cụm chồi mà không có sự hình thành mô sẹo kèm theo (ảnh 7B3, 7B4, 7B5), nhưng khi tăng nồng độ BA lên 2 mg/l ở môi trường MS½+ NAA 0,1 mg/l + BA 2 mg/l