2.2.4.1. Phương tiện nghiên cứu - Dụng cụ, thiết bị:
+ Giấy, bút, phiếu điều tra. + Ống tiêm 5ml, gòn, cồn.
+ Ống đựng máu có chứa chất chống đông EDTA. + Máy đếm tế bào dòng chảy FACS CANTO II + Pipette, đầu tip phù hợp với pipet.
+ Đồng hồ đếm ngược. + Tủ lạnh sâu -20 C.
- Hóa chất
+ Kháng thể đơn dòng: Multitest 6-color TBNK reagent trong đó bao gồm anti CD3, anti CD16/56, anti CD45, anti CD19, anti CD4 và anti CD8.
+ Dung dịch ly giải hồng cầu.
2.2.4.2. Thu thập số liệu
- Ghi nhận các yếu tố về tuổi, giới, địa chỉ, các dấu hiệu lâm sàng và cận lâm sàng qua bệnh án tại Bệnh viện Lao và Bệnh phổi Thành phố Cần Thơ theo đúng phiếu thu thập số liệu soạn sẵn.
- Lấy mẫu và bảo quản mẫu: + Lấy máu, ly trích.
+ Bảo quản máu bệnh nhân ở nhiệt độ -20o
C. - Xử lí mẫu máu chứa các tế bào lympho.
- Phân loại các tế bào lympho bằng phương pháp đếm dòng chảy tế bào (flow cytometry) thông qua việc xác định các dấu ấn đặc trưng của tế bào lympho khác nhau.
2.2.4.3. Cách lấy mẫu
- Sử dụng ống lấy mẫu có chất chống đông EDTA (Ethylene di-amine tetra- acetic acid). Chất chống đông EDTA phù hợp với các xét nghiệm công thức máu và phân tích các tế bào máu vì nó bảo quản hình thái tế bào tốt nhất.
- Ghi ngày giờ lấy mẫu, mã số hoặc họ tên, tuổi, giới tính của bệnh nhân trên nhãn của ống đựng máu.
- Vị trí lấy máu: tĩnh mạch cánh tay
- Thể tích máu lấy: 2ml.
- Đảo ngược ống nhẹ nhàng 8 - 10 lần.
- Để ống máu thẳng đứng trên giá, bảo quản ở nhiệt độ phòng, tránh ánh nắng trực tiếp.
2.2.4.4. Quy trình xử lý mẫu máu chứa các tế bào lympho
- Đánh dấu mã số mẫu máu vào ống BD Trucount.
- Dùng pipette hút 20µL thuốc thử BD Multitest 6-color cho vào ống Trucount.
- Dùng pipette hút 50 µL máu có chất chống đông vào ống.
- Đậy nắp ống và lắc nhẹ trộn đều hổn hợp dung dịch. Ủ ống 15 phút trong bóng tối ở nhiệt độ phòng (20-25o
C).
- Cho thêm vào ống 450 µL dung dịch ly giải hồng cầu. Chú ý tránh chiếu ánh sáng trực tiếp vào ống.
- Đậy nắp ống và lắc nhẹ trộn đều hổn hợp dung dịch. Ủ ống 15 phút trong bóng tối ở nhiệt độ phòng (20-25oC) rồi cho vào máy phân loại các tế bào lympho bằng phương pháp Flow Cytometry.
2.2.4.5. Quy trình căn bản sử dụng máy đếm dòng chảy tế bào
- Khởi động máy: chuẩn bị dung dịch nạp mẫu bao gồm các bước chuẩn bị dung dịch đệm, bật máy và chọn phần mềm tương thích, rửa máy khởi động và đuổi khí trong hệ thống buồng đếm.
- Chuẩn máy: thông thường các hãng khác nhau có thể sử dụng các hóa chất tinh khiết để chuẩn máy. Chuẩn máy có thể được sử dụng để cân chỉnh các kênh thu nhận tín hiệu huỳnh quang hoặc có thể đánh giá độ chính xác của pipette (FacsCount, Guava). Nếu máy đạt các tình trạng tốt thì tiến hành xử lý và phân tích mẫu. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Xử lý mẫu: mẫu máu toàn phần với thể tích xác định theo từng quy trình cụ thể sẽ được ủ với kháng thể đặc hiệu để có thể phát hiện quần thể tế bào lympho T-CD4. Tùy loại sinh phẩm được sử dụng mà kết quả thu nhận có thể có các giá trị về phần trăm lympho T-CD4, số lượng tuyệt đối lympho T-CD4 hoặc cả hai. Trong một quy trình chuẩn, mẫu chứng nội được sử dụng để đánh giá toàn bộ quy trình, đảm bảo tính chính xác của xét nghiệm. Mẫu chuẩn hoặc mẫu chứng phải được đưa vào phân tích đầu tiên và được đánh giá kết quả trước khi phân tích mẫu bệnh nhân.
- Ly giải hồng cầu: hồng cầu trong mẫu nhuộm sẽ được ly giải trước khi đưa vào phân tích bằng các dung dịch ly giải theo bộ sinh phẩm. Sau khi ly giải hồng cầu, mẫu có thể được đưa vào phân tích ngay hoặc ở một số quy trình hai máy thì có thể tiến hành trung hòa và loại bỏ mảnh vỡ tế bào thông qua rửa bằng dung dịch đệm PBS với tỉ lệ 1:1.
- Chạy, phân tích mẫu và ghi nhận kết quả: các quy trình một máy với bộ sinh phẩm theo máy thường được tiến hành phân tích tự động và không cho can thiệp. Tuy nhiên trong các trường hợp mẫu bất thường về hình thái cũng như
mức độ nhuộm màu huỳnh quang, kỹ thuật viên cần nắm rõ các vấn đề về kỹ thuật cũng như các chiến lược tạo cổng và chọn lọc quần thể để tránh sai sót có thể xảy ra. Trong một số hệ thống máy, kỹ thuật viên phải tự phân tích và phân vùng quần thể để thu kết quả.
- Rửa và tắt máy: sau quá trình chạy mẫu thì việc rửa máy là hết sức quan trọng, nó giúp loại bỏ những mảng bám phát sinh trong quá trình chạy giúp hạn chế tắc nghẽn hệ thống dung dịch lỏng. Dung dịch rửa máy thường đi kèm theo bộ sinh phẩm thường có bản chất là chất tẩy nhẹ như Javel, sau quá trình rửa bằng chất tẩy thì máy bắt buộc phải rửa lại bằng nước cất để tránh bị ăn mòn.
Sơ đồ nghiên cứu
NHÓM BỆNH NHÓM ĐỐI CHỨNG
Ghi nhận: tuổi, giới, địa chỉ…
Lấy máu cho vào ống đựng có chứa sẵn chất chống đông EDTA
Phân tích mẫu bằng phương pháp Flow Cytometry
KẾT QUẢ
Xét nghiệm tổng phân tích công thức máu
- Ghi nhận: tuổi, giới, địa chỉ… - Dấu hiệu lâm sàng