lao phổi
- Tác giả Al Majid FM (2008), nghiên cứu tại Ả Rập Saudi trên 54 bệnh nhân lao phổi và 25 người bình thường làm nhóm đối chứng cho kết quả số lượng tế bào ở bệnh nhân lao phổi như sau: lympho T (CD3) là 1091,9 ± 321,4 (TB/µL), tế bào lympho B (CD19) là 192,3 ± 132,8 (TB/µL), tế bào NK (CD16/56) là 410,7 ± 286 (TB/µL), tế bào T-CD4 là 639,8 ± 285 (TB/µL) và T- CD8 là 609 ± 233,5 (TB/µL). Khi so sánh các tế bào giữa nhóm bệnh và nhóm
đối chứng cho kết quả: số lượng lympho T (CD3) và T-CD4 giảm ở nhóm bệnh, số lượng NK (CD16/56) tăng ở nhóm bệnh, T-CD8 và lympho B (CD19) không khác biệt giữa hai nhóm [19].
- Nghiên cứu của tác giả Jesus Hernandez và cộng sự (2010), nghiên cứu tại Mỹ trên 17 bệnh nhân lao phổi, nhóm đối chứng 17 người bình thường cho kết quả: số lượng tế bào lympho B (CD19) nhóm bệnh thấp hơn nhóm đối chứng, số lượng lympho T (CD3), T-CD4 và T-CD8 không khác biệt giữa nhóm bệnh và nhóm đối chứng [28].
- Nghiên cứu của Setareh Davoudi và cộng sự (2008), nghiên cứu tại Iran trên 26 bệnh nhân lao phổi, nhóm đối chứng 16 người khỏe mạnh cho kết quả: T-CD4 và T-CD8 ở bệnh nhân lao phổi lần lượt là 695,42 ± 409,77 (TB/µL) và 556,2 ± 267,42 (TB/µL). Số lượng T-CD4 và T-CD8 ở nhóm bệnh thấp hơn nhóm đối chứng [34].
- Nghiên cứu của D.S.S. Rodrigues và cộng sự (2002) ở Mỹ, trên 20 bệnh nhân lao phổi, so sánh với nhóm đối chứng 18 người bình thường cho kết quả số lượng T-CD4 và T-CD8 ở nhóm bệnh thấp hơn nhóm đối chứng [21].
- Tác giả Nadeem Afzal và cs (2010), tại Paskitan, nghiên cứu trên 39 bệnh nhân lao phổi, so sánh với nhóm đối chứng 38 người bình thường cho kết quả ở nhóm bệnh: trung bình bạch cầu chung là 8,1 ± 3,3 (10^9/L), trung bình bạch cầu lympho 1,92 ± 0,73 (10^9/L), trung bình bạch cầu mono 0,8 ± 0,33 (10^9/L), trung bình bạch cầu hạt 5,3 ± 0,82 (10^9/L). Khi so sánh số lượng tế bào bạch cầu chung giữa nhóm bệnh lao phổi với nhóm đối chứng thì kết quả không tìm thấy sự khác biệt (p > 0,05) [30].
CHƯƠNG 2
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1.Đối tượng nghiên cứu 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu
- Nhóm bệnh: những bệnh nhân mắc lao phổi mới đang được điều trị tại bệnh viện Lao và Bệnh phổi Cần Thơ.
- Nhóm đối chứng: người bình thường khám sức khỏe định kì tại bệnh viện Trường Đại Học Y Dược Cần Thơ.
2.1.2. Tiêu chuẩn chọn đối tượng nghiên cứu 2.1.2.1. Nhóm bệnh nhân mắc lao phổi mới 2.1.2.1. Nhóm bệnh nhân mắc lao phổi mới
- Bệnh nhân được chẩn đoán lao phổi lần đầu hoặc bệnh nhân đã được chẩn đoán và điều trị lao phổi trước đây nhưng thời gian điều trị dưới 1 tháng.
- Trên 15 tuổi.
2.1.2.2. Nhóm đối chứng
- Những người đến khám sức khỏe định kỳ tại bệnh viện Đại Học Y Dược Cần Thơ có xét nghiệm công thức máu, sinh hóa máu bình thường.
- Trên 15 tuổi.
2.1.3. Tiêu chuẩn loại trừ
Loại trừ những đối tượng đạt tiêu chuẩn chọn nhưng kèm theo một trong các tiêu chuẩn sau:
- Những người bị nhiễm HIV hoặc các bệnh nhiễm trùng khác. - Những người có bệnh mạn tính.
- Những người đang sử dụng thuốc ức chế miễn dịch. - Những người không đồng ý tham gia nghiên cứu.
2.1.4. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
Thời gian thực hiện nghiên cứu từ tháng 07/2013 đến tháng 05/2014, mẫu máu của nhóm bệnh và nhóm đối chứng được thu thập tại phòng xét nghiệm của Bệnh viện Lao và bệnh phổi Cần Thơ và phòng xét nghiệm của bệnh viện Trường Đại học Y Dược Cần Thơ.
2.2. Phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Thiết kế nghiên cứu
Nghiên cứu mô tả cắt ngang.
2.2.2. Mẫu nghiên cứu2.2.2.1. Cỡ mẫu 2.2.2.1. Cỡ mẫu
Trong thời gian từ tháng 07/2013 đến tháng 05/2014 chúng tôi thu thập được 31 bệnh nhân lao phổi mới (nhóm bệnh).
Ở nhóm đối chứng chúng tôi chọn 33 người bình thường. - Tương đồng với nhóm bệnh.
- Chi phí thực hiện đề tài cao vì các xét nghiệm đắt tiền. - Chọn mẫu thuận tiện với cỡ mẫu ≥ 30 đạt độ tin cậy ≥ 95%.
2.2.2.2. Phương pháp chọn mẫu
Chọn mẫu thuận tiện ngẫu nhiên không xác suất.
2.2.3. Nội dung nghiên cứu
2.2.3.1. Đặc điểm của bệnh nhân mắc lao phổi mới
(a) Nhóm tuổi tính theo năm và được phân ra 3 nhóm tuổi là dưới 30 tuổi, từ 30 đến 60 tuổi và trên 60 tuổi.
(c) Triệu chứng lâm sàng: ho khan; ho có đàm; ho ra máu; sụt cân; sốt nhẹ về chiều; ra mồ hôi trộm; đau ngực; khó thở; rale ở phổi; kém ăn, mệt mỏi; triệu chứng khác.
(d) Cận lâm sàng giúp chẩn đoán:
- Soi đàm trực tiếp tìm AFB: có hay không? - Cấy đàm tìm BK: có hay không?
2.2.3.2. Xác định số lượng các tế bào miễn dịch
Các tế bào miễn dịch bào gồm:
- Các loại tế bào bạch cầu: bạch cầu lympho, bạch cầu mono, bạch cầu hạt. - Các tế bào lympho: lympho T (CD3), lympho B (CD19), NK (CD16/56), T- CD4, T-CD8.
(a) Sử dụng xét nghiệm công thức máu để xác định số lương bạch cầu chung, bạch cầu lympho, bạch cầu mono và bạch cầu hạt.
- Bạch cầu chung là tất cả các loại bạch cầu trong máu ngoại vi bao gồm bạch cầu lympho, bạch cầu mono, bạch cầu hạt
- Bạch cầu lympho là loại bạch cầu chuyên biệt cho hệ miễn dịch, bao gồm lympho T, lympho B và NK.
- Bạch cầu mono là bạch cầu đơn nhân, khi trưởng thành nó có thể biệt hóa thành đại thực bào tại các mô khác nhau của cơ thể.
- Bạch cầu hạt được đặc trưng bởi các hạt nhuộm màu khác nhau trong tế bào chất dưới kính hiển vi quang học. Có ba loại bạch cầu hạt: bạch cầu trung tính (neutrophil), bạch cầu ái kiềm (basophil) và bạch cầu ái toan (eosinophil). (b) Sử dụng xét nghiệm đếm dòng chảy tế bào với kít xét nghiệm của hãng BD để xác định số lượng CD3, CD4, CD8, CD19 và CD16/56.
- Phân tử CD3: Nó có mặt ở mọi tế bào lympho chín. Vai trò của nó là tiếp xúc với kháng nguyên trên phân tử MHC của tế bào trình diện tương ứng và truyền đạt tín hiệu vào trong nguyên sinh chất của tế bào lympho T.
- Phân tử CD4: Đó là một monome có 4 khu vực nằm bê ngoài tế bào. CD4 là đặc trưng của dưới nhóm quần thể tế bào lympho T hỗ trợ và được dùng như là phối tử với các phân tử MHC lớp II, nó cũng là receptor cho HIV.
- Phân tử CD8: Được hình thành bởi 2 chuỗi α và β nối lại với nhau bằng 1 dây đồng hóa trị. CD8 đặc trưng cho dưới nhóm quần thể tế bào lympho T độc. CD8 là phối tử với phân tử MHC lớp I.
- CD19: Có ở tất cả các tế bào lympho B trừ tương bào. - CD16/56: Có mặt ở các tế bào Natural Killer (NK).
2.2.3.3. Xác định sự thay đổi về số lượng các tế bào miễn dịch ở bệnh nhân lao phổi mới so với người bình thường
So sánh kết quả về số lượng các tế bào miễn dịch của nhóm bệnh nhân lao phổi mới và nhóm đối chứng, tính mức ý nghĩa (p) theo phép toán thống kê, kết luận sự khác biệt về số lượng các tế bào miễn dịch ở hai nhóm.
2.2.4. Phương pháp thu thập số liệu 2.2.4.1. Phương tiện nghiên cứu 2.2.4.1. Phương tiện nghiên cứu - Dụng cụ, thiết bị:
+ Giấy, bút, phiếu điều tra. + Ống tiêm 5ml, gòn, cồn.
+ Ống đựng máu có chứa chất chống đông EDTA. + Máy đếm tế bào dòng chảy FACS CANTO II + Pipette, đầu tip phù hợp với pipet.
+ Đồng hồ đếm ngược. + Tủ lạnh sâu -20 C.
- Hóa chất
+ Kháng thể đơn dòng: Multitest 6-color TBNK reagent trong đó bao gồm anti CD3, anti CD16/56, anti CD45, anti CD19, anti CD4 và anti CD8.
+ Dung dịch ly giải hồng cầu.
2.2.4.2. Thu thập số liệu
- Ghi nhận các yếu tố về tuổi, giới, địa chỉ, các dấu hiệu lâm sàng và cận lâm sàng qua bệnh án tại Bệnh viện Lao và Bệnh phổi Thành phố Cần Thơ theo đúng phiếu thu thập số liệu soạn sẵn.
- Lấy mẫu và bảo quản mẫu: + Lấy máu, ly trích.
+ Bảo quản máu bệnh nhân ở nhiệt độ -20o
C. - Xử lí mẫu máu chứa các tế bào lympho.
- Phân loại các tế bào lympho bằng phương pháp đếm dòng chảy tế bào (flow cytometry) thông qua việc xác định các dấu ấn đặc trưng của tế bào lympho khác nhau.
2.2.4.3. Cách lấy mẫu
- Sử dụng ống lấy mẫu có chất chống đông EDTA (Ethylene di-amine tetra- acetic acid). Chất chống đông EDTA phù hợp với các xét nghiệm công thức máu và phân tích các tế bào máu vì nó bảo quản hình thái tế bào tốt nhất.
- Ghi ngày giờ lấy mẫu, mã số hoặc họ tên, tuổi, giới tính của bệnh nhân trên nhãn của ống đựng máu.
- Vị trí lấy máu: tĩnh mạch cánh tay
- Thể tích máu lấy: 2ml.
- Đảo ngược ống nhẹ nhàng 8 - 10 lần.
- Để ống máu thẳng đứng trên giá, bảo quản ở nhiệt độ phòng, tránh ánh nắng trực tiếp.
2.2.4.4. Quy trình xử lý mẫu máu chứa các tế bào lympho
- Đánh dấu mã số mẫu máu vào ống BD Trucount.
- Dùng pipette hút 20µL thuốc thử BD Multitest 6-color cho vào ống Trucount.
- Dùng pipette hút 50 µL máu có chất chống đông vào ống.
- Đậy nắp ống và lắc nhẹ trộn đều hổn hợp dung dịch. Ủ ống 15 phút trong bóng tối ở nhiệt độ phòng (20-25o
C).
- Cho thêm vào ống 450 µL dung dịch ly giải hồng cầu. Chú ý tránh chiếu ánh sáng trực tiếp vào ống.
- Đậy nắp ống và lắc nhẹ trộn đều hổn hợp dung dịch. Ủ ống 15 phút trong bóng tối ở nhiệt độ phòng (20-25oC) rồi cho vào máy phân loại các tế bào lympho bằng phương pháp Flow Cytometry.
2.2.4.5. Quy trình căn bản sử dụng máy đếm dòng chảy tế bào
- Khởi động máy: chuẩn bị dung dịch nạp mẫu bao gồm các bước chuẩn bị dung dịch đệm, bật máy và chọn phần mềm tương thích, rửa máy khởi động và đuổi khí trong hệ thống buồng đếm.
- Chuẩn máy: thông thường các hãng khác nhau có thể sử dụng các hóa chất tinh khiết để chuẩn máy. Chuẩn máy có thể được sử dụng để cân chỉnh các kênh thu nhận tín hiệu huỳnh quang hoặc có thể đánh giá độ chính xác của pipette (FacsCount, Guava). Nếu máy đạt các tình trạng tốt thì tiến hành xử lý và phân tích mẫu.
- Xử lý mẫu: mẫu máu toàn phần với thể tích xác định theo từng quy trình cụ thể sẽ được ủ với kháng thể đặc hiệu để có thể phát hiện quần thể tế bào lympho T-CD4. Tùy loại sinh phẩm được sử dụng mà kết quả thu nhận có thể có các giá trị về phần trăm lympho T-CD4, số lượng tuyệt đối lympho T-CD4 hoặc cả hai. Trong một quy trình chuẩn, mẫu chứng nội được sử dụng để đánh giá toàn bộ quy trình, đảm bảo tính chính xác của xét nghiệm. Mẫu chuẩn hoặc mẫu chứng phải được đưa vào phân tích đầu tiên và được đánh giá kết quả trước khi phân tích mẫu bệnh nhân.
- Ly giải hồng cầu: hồng cầu trong mẫu nhuộm sẽ được ly giải trước khi đưa vào phân tích bằng các dung dịch ly giải theo bộ sinh phẩm. Sau khi ly giải hồng cầu, mẫu có thể được đưa vào phân tích ngay hoặc ở một số quy trình hai máy thì có thể tiến hành trung hòa và loại bỏ mảnh vỡ tế bào thông qua rửa bằng dung dịch đệm PBS với tỉ lệ 1:1.
- Chạy, phân tích mẫu và ghi nhận kết quả: các quy trình một máy với bộ sinh phẩm theo máy thường được tiến hành phân tích tự động và không cho can thiệp. Tuy nhiên trong các trường hợp mẫu bất thường về hình thái cũng như
mức độ nhuộm màu huỳnh quang, kỹ thuật viên cần nắm rõ các vấn đề về kỹ thuật cũng như các chiến lược tạo cổng và chọn lọc quần thể để tránh sai sót có thể xảy ra. Trong một số hệ thống máy, kỹ thuật viên phải tự phân tích và phân vùng quần thể để thu kết quả.
- Rửa và tắt máy: sau quá trình chạy mẫu thì việc rửa máy là hết sức quan trọng, nó giúp loại bỏ những mảng bám phát sinh trong quá trình chạy giúp hạn chế tắc nghẽn hệ thống dung dịch lỏng. Dung dịch rửa máy thường đi kèm theo bộ sinh phẩm thường có bản chất là chất tẩy nhẹ như Javel, sau quá trình rửa bằng chất tẩy thì máy bắt buộc phải rửa lại bằng nước cất để tránh bị ăn mòn.
Sơ đồ nghiên cứu
NHÓM BỆNH NHÓM ĐỐI CHỨNG
Ghi nhận: tuổi, giới, địa chỉ…
Lấy máu cho vào ống đựng có chứa sẵn chất chống đông EDTA
Phân tích mẫu bằng phương pháp Flow Cytometry
KẾT QUẢ
Xét nghiệm tổng phân tích công thức máu
- Ghi nhận: tuổi, giới, địa chỉ… - Dấu hiệu lâm sàng
2.2.5. Phương pháp hạn chế sai số
- Lấy máu bệnh nhân buổi sáng trước khi ăn cho tất cả đối tượng tham gia nghiên cứu.
- Sử dụng cùng một máy xét nghiệm cho mỗi loại xét nghiệm, sử dụng cùng bộ kít xét nghiệm.
2.2.6. Xử lý số liệu và phân tích kết quả
- Làm sạch số liệu.
- Sử dụng phần mềm thống kê SPSS 18.0 for windows.
- Biến phân phối chuẩn bao gồm bạch cầu chung, bạch cầu lympho, bạch cầu hạt, CD3, CD4, CD8, CD16/56.
- Biến phân phối không chuẩn là số lượng bạch cầu mono và CD19.
- Dùng thuật toán giá trị trung bình, trung vị, giá trị lớn nhất, giá trị nhỏ nhất để mô tả độ tuổi, số lượng các tế bào miễn dịch của đối tượng nghiên cứu.
- Dùng phép kiểm định giá trị trung bình Independent sample T cho biến phân phối chuẩn và kiểm định Mann – Whitney U cho biến phân phối không chuẩn để so sánh số lượng các tế bào miễn dịch của nhóm bệnh với nhóm đối chứng.
- Dùng kiểm định ANOVA cho biến phân phối chuẩn và kiểm định Kruskal – Wallis cho biến phân phối không chuẩn so sánh số lượng các tế bào giữa các nhóm tuổi.
- Trình bày kết quả bằng bảng, biểu đồ.
2.3. Đạo đức nghiên cứu
Các đối tượng tham gia nghiên cứu là hoàn toàn tự nguyện, công tác lấy máu được thực hiện bởi nhân viên y tế có kinh nghiệm đúng nguyên tắc vô trùng. Đối tượng được lấy 2ml máu vào buổi sáng trước ăn. Lượng máu mất đi
không ảnh hưởng đến sức khỏe bệnh nhân. Kết quả xét nghiệm công thức máu được gửi trả cho bệnh nhân miễn phí, kết quả xét nghiệm CD cũng được gửi trả nếu bệnh nhân có yêu cầu.
Các thông tin về cá nhân người bệnh được giữ bí mật.
Các kết quả nghiên cứu nhằm xây dựng các chỉ tiêu miễn dịch, làm sáng tỏ khả năng đáp ứng miễn dịch của bệnh nhân nhằm cung cấp thêm thông tin cho việc điều trị bệnh lao một cách có hiệu quả, quá trình thực hiện an toàn, chúng tôi tin rằng nghiên cứu này không vi phạm các vấn đề y đức.
CHƯƠNG 3
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1. Đặc điểm chung của mẫu nghiên cứu
3.1.1. Đặc điểm về giới tính
Bảng 3.1. Phân bố giới tính ở nhóm đối chứng và nhóm bệnh nhân lao phổi mới
Giới tính Nhóm đối chứng Nhóm bệnh Số lượng Tỷ lệ (%) Số lượng Tỷ lệ (%) Nam 15 45,5 25 80,6 Nữ 18 54,5 6 19,4 Tổng 33 100 31 100 Nhận xét:
- Nhóm đối chứng có 18/33 người là nữ giới chiếm 54,5%, có 15/33 người là nam giới chiếm 45,5%, tỉ lệ nam/nữ của nhóm đối chứng là 0,83.
- Nhóm lao phổi mới có 25/31 bệnh nhân là nam giới chiếm tỷ lệ là 80,6%, trong khi chỉ có 6/31 bệnh nhân là nữ chiếm 19,4%, như vậy nam giới xấp xỉ gấp