C. Xenlulolyticum + Que Ưa nhiệt, trung
Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.3.1. Nghiên cứu các thông số kĩ thuật lên men nhân sinh khối của các chủng vi sinh vật lựa chọn.
chủng vi sinh vật lựa chọn.
đề tài ựã sử dụng phương pháp lên men chìm trong thiết bị lên men dung tắch 3l/mẻ (ở quy mô phòng thắ nghiệm) ựể nhân sinh khối vi sinh vật, ựây là phương pháp phổ biến trong quy trình lên men công nghiệp, vì có thể kiểm soát ựược các khâu trong quá trình một cách dễ dàng. Với phương pháp lên men chìm, vi sinh vật ựược nuôi cấy trong môi trường dịch thể, chúng sẽ phát triển theo chiều ựứng của cột môi trường.
a.Nhân sinh khối các chủng vi khuẩn có khả năng phân giải xenlulo
Các thông số kỹ thuật tối ưu cho lên men nhân sinh khối ựược kiểm soát và duy trì trong suốt quá trình lên men bao gồm: ựiều kiện về nhiệt ựộ, pH, hàm lượng oxy hoà tan, môi trường dinh dưỡng.
Ớ Ảnh hưởng của pH
Trong quá trình lên men nhân sinh khối, do ảnh hưởng của các sản phẩm của quá trình trao ựổi chất nên pH của môi trường nuôi cấy luôn bị thay ựổi. Mỗi loài vi sinh vật ựều có một pH môi trường tối ưu cho sự sinh trưởng và phát triển, cho nên sự thay ựổi pH của môi trường nuôi cấy trong quá trình lên men nhân sinh khối sẽ có những ảnh hưởng tiêu cực ựến sự sinh trưởng và phát triển của chủng vi sinh vật ựó. Do vậy, việc xác ựịnh ựược pH môi trường tối ưu cho các chủng vi sinh vật nghiên cứu là hết sức cần thiết.
Tiến hành xác ựịnh pH môi trường thắch hợp trong quá trình lên men cho các chủng vi khuẩn lựa chọn ở các pH 5,0; 5,5; 6,0; 6,5; 7,0; 7,5; 8,0 theo phương pháp ựã nêu ở trên. Các yếu tố khác không thay ựổi, với tốc ựộ sục khắ 0,75 lắt không khắ/lắt môi trường/phút; nhiệt ựộ 300C; tốc ựộ cánh khuấy 350 vòng/phút. Kết quả ựược tổng hợp tại bảng 3.8.
Bảng 3.8 Ảnh hưởng pH môi trường ựến mật ựộ và hoạt tắnh sinh học của các chủng vi khuẩn hữu ắch
Mật ựộ tế bào của các chủng vi sinh vật ở các pH khác nhau (CFU/ml)
STT Ký hiệu
chủng 5,0 5,5 6,0 6,5 7,0 7,5 8,0
1 V12 3,60x105 3,12x107 7,51x107 3,38x108 8,54x109 5,64x108 3,52x108
2 V14 2,42x105 3,24x106 3,18x107 3,34x108 8,72x109 6,34x108 5,44x107
ỘNguồn: tổng hợp theo kết quả thắ nghiệmỢ
Số liệu bảng 3.8 cho thấy, các chủng vi khuẩn lựa chọn có khả năng sinh trưởng và phát triển trong môi trường nuôi cấy có pH dao ựộng trong khoảng 5,0 Ờ 8,0. Tuy nhiên, khả năng sinh trưởng và phát triển các chủng vi khuẩn lựa chọn ở các ựiều kiện pH môi trường khác nhau có sự biến ựộng khá rõ rệt. Mật ựộ của các chủng vi khuẩn lựa chọn ựạt cao nhất khi môi trường nuôi cấy có pH bằng 7,0, còn nếu môi trường nuôi cấy có pH cao hơn hoặc thấp hơn khoảng pH này thì mật ựộ tế bào của các chủng ựều giảm. Như vậy, có thể lên men nhân sinh khối các chủng vi khuẩn lựa chọn ở môi trường có pH là 7,0.
Ớ Ảnh hưởng của nhiệt ựộ
Nhiệt ựộ là yếu tố quan trọng có ảnh hưởng lớn ựến sự sinh trưởng, phát triển của vi sinh vật và hiệu quả của quá trình lên men nhân sinh khối. Vì mỗi loài vi sinh vật ựều có một mức nhiệt ựộ tối ưu khác nhau ựể sinh trưởng và phát triển.
để xác ựịnh ựược nhiệt ựộ tối ưu cho quá trình lên men nhân sinh khối, các chủng vi khuẩn lựa chọn ựược lên men nhân sinh khối ở các ựiều kiện nhiệt ựộ khác
nhau (150C, 200C, 250C, 300C, 350C, 400C). Các yếu tố khác không thay ựổi, với pH
= 7,0; tốc ựộ sục khắ 0,75 lắt không khắ/lắt môi trường/phút; tốc ựộ cánh khuấy 350
vòng/phút. Kết quả ựánh giá ảnh hưởng của nhiệt ựộ ựến quá trình sinh trưởng và phát triển của các chủng vi khuẩn lựa chọn ựược tổng hợp ở bảng 3.9.
Bảng 3.9 Ảnh hưởng của nhiệt ựộ ựến sự sinh trưởng và phát triển của các chủng vi khuẩn
Mật ựộ tế bào các chủng vi khuẩn tại các nhiệt ựộ lên men khác nhau (CFU/ml) STT Ký hiệu chủng 150C 200C 250C 300C 350C 400C 1 V12 2,42x103 3,67x105 1,42x108 8,28x109 5,46x109 4,52x106 2 V14 3,02x104 6,12x106 3,68x108 7,77x108 5,32x108 3,34x107
ỘNguồn: tổng hợp theo kết quả thắ nghiệmỢ
Số liệu bảng 3.9 cho thấy, nhiệt ựộ nuôi cấy có ảnh hưởng lớn ựến quá trình sinh trưởng và phát triển của các chủng vi khuẩn lựa chọn, ở các khoảng nhiệt ựộ khác nhau thì mật ựộ tế bào của các chủng cũng khác nhau. Các chủng vi khuẩn này
có khả năng sinh trưởng và phát triển trong khoảng nhiệt ựộ từ 15 Ờ 400C, tuy nhiên
khoảng nhiệt ựộ thắch hợp cho các chủng này sinh trưởng phát triển nằm trong
khoảng từ 25- 350C. Trong khoảng nhiệt ựộ nuôi cấy này, mật ựộ tế bào của các
chủng vi khuẩn lựa chọn ựều ựạt mật ựộ từ 108 Ờ 109 CFU/ml. Ở các khoảng nhiệt
ựộ nuôi cấy dưới 250C và cao hơn 350C thì các chủng vi khuẩn này sinh trưởng phát
triển kém, mật ựộ tế bào cao nhất cũng chỉ ựạt 107 CFU/ml. Trong khoảng nhiệt ựộ
từ 25 - 350C thì mật ựộ tế bào của các chủng vi khuẩn này sinh trưởng phát triển tốt
Như vậy, khoảng nhiệt ựộ tối ưu cho quá trình lên men nhân sinh khối của
các chủng vi khuẩn lựa chọn là khoảng 300C.
Ớ Ảnh hưởng của tốc ựộ sục khắ
Ôxy là một trong những yếu tố có ảnh hưởng lớn ựến quá trình lên men nhân sinh khối vi sinh vật vì mỗi loài vi sinh vật ựều có nhu cầu ôxy khác nhau. Do ựó, nghiên cứu xác ựịnh ựược nồng ựộ ôxy thắch hợp cho sự sinh trưởng và phát triển của các chủng vi sinh vật hữu ắch trong quá trình lên men nhân sinh khối là cần thiết.
để xác ựịnh ựược tốc ựộ sục khắ thắch hợp cho quá trình lên men nhân sinh
khối, các chủng vi khuẩn lựa chọn ựược lên men nhân sinh khối ở các mức không khắ ựược sục vào lần lượt là 0,60; 0,65; 0,70; 0,75; 0,80; 0,85 lắt không khắ/lắt môi
trường/phút. Các yếu tố khác không thay ựổi, với pH = 7,0; nhiệt ựộ 300C; tốc ựộ
cánh khuấy 350 vòng/phút. Kết quả nghiên cứu xác ựịnh tốc ựộ sục khắ thắch hợp cho quá trình lên men nhân sinh khối các chủng vi khuẩn lựa chọn ựược tổng hợp trong bảng 3.10.
Bảng 3.10 Ảnh hưởng của tốc ựộ sục khắ ựến mật ựộ tế bào của các chủng vi khuẩn lựa chọn
Mật ựộ tế bào của các chủng vi khuẩn với các tốc ựộ sục khắ (CFU/ml)
STT Ký
hiệu
chủng 0,60 0,65 0,70 0,75 0,80 0,85
1 V12 7,32 x 107 7,87 x 108 7,92 x 109 8,72 x 109 6,62 x 108 5,92 x 108
2 V14 3,28 x 107 8,36 x 107 4,57 x 108 6,56 x 108 6,54 x 107 6,22 x 107
ỘNguồn: tổng hợp theo kết quả thắ nghiệmỢ
Kết quả bảng 3.10 cho thấy, các chủng vi khuẩn lựa chọn ựều có khả năng sinh trưởng và phát triển với lượng không khắ cung cấp vào quá trình lên men dao ựộng từ 0,60 - 0,85 lắt/lắt môi trường/phút. Các chủng vi khuẩn lựa chọn sinh trưởng và phát triển tốt nhất khi lượng không khắ cung cấp vào trong quá trình lên men là
0,70 - 0,75 lắt/lắt môi trường /phút, với lượng không khắnày thì mật ựộ tế bào của
các chủng ựều ựạt từ 108 - 109 CFU/ml. Khi lượng không khắ cung cấp vào thấp hơn
0,70 hoặc cao hơn 0,75 lắt/lắt môi trường /phút thì mật ựộ tế bào ựều thấp và chỉ ựạt
Như vậy, các chủng vi khuẩn lựa chọn có khả năng sinh trưởng và phát triển tốt nhất trong quá trình lên men khi lượng không khắ cung cấp vào nằm trong khoảng 0,70 - 0,75 lắt/lắt môi trường /phút.
Ớ Ảnh hưởng tốc ựộ cánh khuấy
Tốc ựộ cánh khuấy ảnh hưởng ựến diện tắch tiếp xúc giữa tế bào và môi trường dinh dưỡng, hoà ựều không khắ vào môi trường dinh dưỡng, tránh yếm khắ cục bộ ngoài ra nó còn có tác dụng ngăn cản sự kết lắng của tế bào. Do ựó, nó ảnh hưởng rất lớn ựến khả năng sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật trong quá trình lên men.
để xác ựịnh ựược tốc ựộ cánh khuấy thắch hợp cho quá trình lên men nhân
sinh khối, các chủng vi khuẩn lựa chọn ựược lên men nhân sinh khối ở tốc ựộ cánh
khuấylần lượt là 250; 300; 350; 400; 450 vòng/phút. Các yếu tố khác không thay
ựổi, với pH = 7,0; nhiệt ựộ 300C; tốc ựộ sục khắ 0,75 lắt/lắt môi trường /phút. Kết
quả ựánh giá ảnh hưởng của tốc ựộ cánh khuấy ựến sự sinh trưởng và phát triển của các chủng vi khuẩn lựa chọn ựược tổng hợp trong bảng 3.11.
Bảng 3.11 Ảnh hưởng của tốc ựộ cánh khuấy ựến mật ựộ tế bào của các chủng vi khuẩn lựa chọn
Mật ựộ tế bào của các chủng vi khuẩn tại các tốc ựộ cánh khuấy (CFU/ml) STT Ký hiệu chủng 250 300 350 400 450 1 V12 3,02 x 107 3,14 x 108 8,38 x 109 5,12 x 109 7,20 x 108 2 V14 5,42 x 106 7,20 x 107 5,52 x 108 4,49 x 108 3,66 x 107
ỘNguồn: tổng hợp theo kết quả thắ nghiệmỢ
Số liệu bảng 3.11 cho thấy, mật ựộ tế bào của các chủng vi khuẩn lựa chọn biến ựộng theo tốc ựộ cánh khuấy trong quá trình lên men, ở các tốc ựộ cánh khuấy khác nhau thì mật ựộ của các chủng vi khuẩn lựa chọn cũng khác nhau. Mật ựộ tế bào của các chủng vi khuẩn lựa chọn ựạt cao nhất khi tốc ựộ cánh khuấy trong quá
trình lên men là 350 vòng/phút, với mật ựộ tế bào ựạt 108 - 109 CFU/ml. Qua bảng
13 cũng cho thấy, ở các mức ựộ tốc ựộ khuấy thấp hơn hoặc nhanh hơn mật ựộ tế
làm hạn chế khả năng hoà tan ôxyvào môi trường, còn tốc ựộ khuấy cao sẽ cản trở sự hấp thụ các chất dinh dưỡng của các chủng vi khuẩn lựa chọn.
Như vậy, tốc ựộ cánh khuấy thắch hợp nhất cho quá trình lên men các chủng vi khuẩn lựa chọn là 350 vòng/phút.
Ớ Môi trường nhân sinh khối
Việc nghiên cứu và lựa chọn ựược những loại môi trường dinh dưỡng vừa có giá thành thấp, vừa ựảm bảo cung cấp ựầy ựủ các chất dinh dưỡng cho sự sinh trưởng và phát triển của các chủng vi khuẩn lựa chọn trong quá trình lên men nhân sinh khối ựể sản xuất chế phẩm là một trong những nhân tố quan trọng quyết ựịnh tới giá thành chế phẩm.
đã tiến hành ựánh giá khả năng sinh trưởng và phát triển của các chủng vi khuẩn lựa chọn trên 3 loại môi trường khác nhau. Trong ựó, có môi trường King B ựược dùng làm môi trường ựối chứng vì ựây là loại môi trường ựã ựược nhiều nhà nghiên cứu khẳng ựịnh là thuận lợi cho sự sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn ựối kháng.
Kết quả ựánh giá khả năng sinh trưởng, phát triển của các chủng vi khuẩn lựa chọn trên các loại môi trường khác nhau ựược thể hiện trong bảng 3.12.
Bảng 3.12 Khả năng sinh trưởng và phát triển của các chủng vi khuẩn lựa chọn trên các loại môi trường khác nhau
Mật ựộ tế bào của các chủng vi sinh vật trong các loại môi trường khác nhau (CFU/ml)
STT Ký hiệu
chủng
Gauzs Hansen King B
1 V12 6,2 x 107 8,4 x 108 4,5 x 107
2 V14 5,1 x 107 7,3 x 108 3,6 x 107
ỘNguồn: tổng hợp theo kết quả thắ nghiệmỢ
Số liệu bảng 3.12 cho thấy, các chủng vi khuẩn lựa chọn có khả năng sinh trưởng, phát triển trên tất cả các môi trường thử nghiệm. Tuy nhiên, khả năng sinh trưởng và phát triển của các chủng vi khuẩn lựa chọn ở các môi trường khác nhau
Như vậy, có thể sử dụng nguồn dinh dưỡng có thành phần như môi trường Hans ựể lên men nhân sinh khối các chủng vi khuẩn lựa chọn ựể sản xuất chế phẩm.
Tỷ lệ giống cấp 1
Trong quá trình lên men nhân sinh khối ngoài các yếu tố về dinh dưỡng, ựiều kiện nuôi cấy thì lượng giống cấp một bổ sung vào quá trình lên men cũng hết sức quan trọng, nó quyết ựịnh chất lượng và giá cả của sản phẩm tạo thành. Vì vậy, việc nghiên cứu ựưa ra một tỷ lệ giống cấp 1 thắch hợp trong quá trình lên men là rất cần thiết.
Kết quả xác ựịnh tỷ lệ giống cấp 1 thắch hợp cho quá trình lên men nhân sinh khối các chủng vi khuẩn lựa chọn ựược tổng hợp trong bảng 3.13.
Bảng 3.13 Ảnh hưởng của tỷ lệ giống cấp 1 ựến mật ựộ tế bào của các chủng vi khuẩn lựa chọn
Mật ựộ tế bào của các chủng vi khuẩn tương ứng với tỷ lệ giống cấp 1 (CFU/ml) STT Ký hiệu chủng 1 (%) 2 (%) 3 (%) 1 V12 3,38 x 109 4,12 x 109 4,49 x 109 2 V14 2,57 x 108 5,42 x 108 6,32 x 108
ỘNguồn: tổng hợp theo kết quả thắ nghiệmỢ
Kết quả bảng 3.13 cho thấy, với các tỷ lệ giống cấp 1 khác nhau thì mật ựộ tế bào của các chủng cũng có sự khác nhau. Ở tất cả các chủng khi lượng giống cấp 1 bổ sung vào là 3% thì mật ựộ tế bào ựều ựạt cao nhất. Tuy nhiên, với lượng giống cấp 1 bổ sung vào là 2% hoặc 3% thì mật ựộ tế bào ựạt ựược cũng không cao hơn nhiều so với khi bổ sung 1%. Do ựó, ựể tiết kiệm chi phắ sản xuất thì lượng giống cấp 1 bổ sung vào cho quá trình lên men các chủng vi khuẩn lựa chọn là 1% là thắch hợp nhất.
Từ những phân tắch trên, các thông số kỹ thuật lên men tối ưu của các chủng vi khuẩn ựược tổng hợp tại bảng 3.14.
Bảng 3.14 Các thông số kỹ thuật lên men tối ưu của các chủng (V12, V14)
TT Thông số kỹ thuật đơn vị ựo Yêu cầu kỹ thuật
1 pH - 7,0
2 Nhiệt ựộ lên men tối ưu oC 30
3 Môi trường lên men - Môi trường Hansen
4 Tốc ựộ cánh khuấy Vòng/phút 350
5 Lưu lượng cấp không khắ. lắt không khắ/lắt
môi trường/phút 0,70 - 0,75
ỘNguồn: tổng hợp theo kết quả thắ nghiệmỢ
Mật ựộ CFU/ml của các chủng (V12, V14) ựược kiểm tra theo các thời gian lên men khác nhau. Kết quả ựược ghi lại trong bảng 3.15.
Bảng 3.15 động thái phát triển của chủng V12trên thiết bị lên men chìm Thời gian nuôi
cấy (giờ)
Mật ựộ tế bào (CFU/ml)
Thời gian nuôi cấy (giờ)
Mật ựộ tế bào (CFU/ml) 0 1,9 x106 30 6,5 x109 6 3,1 x107 36 7,8 x109 12 5,7x107 42 8,3 x109 18 4,5 x108 48 6,1 x108 24 4,8 x 108 - -
ỘNguồn: tổng hợp theo kết quả thắ nghiệmỖỖ
Số liệu bảng 3.15 cho thấy, mật ựộ tế bào (CFU/ml) của chủng V12 ựược theo dõi liên tục trong các khoảng thời gian liên tiếp cách nhau 6 giờ/1 lần. Mật ựộ của chủng vi sinh vật nghiên cứu tăng dần từ 1,9x106 CFU/ml lên 6,5 x109 CFU/ml trong khoảng thời gian từ 0-30 giờ. Trong khoảng thời gian từ 30 - 42 giờ, mật ựộ tế bào của chủng vi sinh vật này ựược duy trì ở mức 109 CFU/ml. Từ 42 giờ trở ựi, mật ựộ tế bào của chủng vi sinh vật có xu hướng giảm dần. Như vậy, thời gian thu sinh khối vi sinh vật ựạt hiệu quả cao nhất là sau 42 giờ lên men.
Bảng 3.16 động thái phát triển của chủng V14 trên thiết bị lên men chìm Thời gian nuôi
cấy (giờ)
Mật ựộ tế bào (CFU/ml)
Thời gian nuôi cấy (giờ)
Mật ựộ tế bào (CFU/ml) 0 5,2 x 106 30 3,2 x 109 6 1,8 x 107 36 5,6 x 109 12 6,0 x 107 42 6,9 x 109 18 2,4 x 108 48 4,1 x 108 24 5,9 x 108 - -
ỘNguồn: tổng hợp theo kết quả thắ nghiệmỢ
Số liệu bảng 3.16 cho thấy chủng V12, mật ựộ tế bào (CFU/ml) của chủng V14 ựược theo dõi liên tục trong các khoảng thời gian liên tiếp cách nhau 6 giờ/1 lần. Mật ựộ của chủng vi sinh vật nghiên cứu tăng dần từ 5,2 x106 CFU/ml lên 3,2 x109 CFU/ml trong khoảng thời gian từ 0-30 giờ. Trong khoảng thời gian từ 30 - 42 giờ, mật ựộ tế bào của chủng vi sinh vật này ựược duy trì ở mức 109 CFU/ml. Từ 42 giờ trở ựi, mật ựộ tế bào của chủng vi sinh